Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
образцы можно хранить в пластиковой упаковке с приложением ярлыка, в
пробирках, пронумерованных соответствующим образом. Алюминиевые поддоны
шириной 20 см, которые легко вдвигаются в морозильную камеру, идеально
подходят для хранения сывороток. Морозильные камеры должны иметь
двустворчатые двери, а каждое отделение - 3-4 полки. Месторасположение
того или иного образца сыворотки в холодильнике должно быть указано в
специальном каталоге.
7.3. Консерванты
Тиомерсал (мертиолят) 1:10 000 или 0,1%-ный (вес . на объем) азид натрия
рекомендуются для длительного хранения сывороток. Ни одно из этих
веществ, однако, не может быть применено in vivo. Т^зиднатрйятормозит
реакции химического связывания и должен быть удален длительным диализом.
Он токсичен и требует осторожного обращения. Растворы следует хранить
плодно закупоренными. Если сыворот-•ка стерильна и хранится при -70°С, то
консёрвшГты не нужны.
Получение поликлональных антител и контроль их качества
91
7.4. Замораживание
Хранящиеся при 4 °С стерильные антисыворотки длительное время сохраняют
свои .свойства, но тем не менее рекомендуют глубокое замораживание,
минимально до -20 °С. Чтобы избежать повторных оттаиваний, порции должны
иметь возможно меньший объем; особо ценные контрольные антисыворотки
хранят аликвотами по 100 мкл в пробирках с крыш-, ками. При длительном
хранении при -20 °С вода возгоняется и вновь замерзает в виде льда в
верхней .части образца. Концентрированные белки агрегируют, образуя
нерастворимый преципитат на дне пробирки. Размороженные образцы перед
началом работы должны быть тщательно перемешаны и подвергнуты скоростному
центрифугированию до разделения на порции. Ферменты, содержащиеся в
сыворотку продолжают разрушать белки и при -20°С. Идеально хранить
сыворотки 'при -60 °С .или ниже, однако такую роскошь можно позволить
лишь в отношении самых ценных реагентов.
7.5. Лиофильное высушивание
Разные образцы сыворотки после высушивания в замороженном состоянии
'имеют неодинаковую растворимость. Лучше применить данный метод ,в случае
небольших объемов ценных реагентов, предварительно проверенных на
растворимость и сохранение активности после регидратации, а также в тех
случаях, когда антисыворотку транспортируют на большие расстояния по
почте и нельзя обеспечить замораживание. На флаконе для лиофильной сушки
отмечают уровень жидкости; отметка будет служить ориентиром для
восстановления препарата дистиллированной водой.
7.6. Плазма
Сбор плазмы позволяет получать большие объемы с меньшим гемолизом.
Большие объемы плазмы у овец и других крупных животных лучше получать с
помощью мешочков для переливания крови с антикоагулянтом, которые можно
заполнять в асептических условиях. Для малых объемов крови цитрат (3,8%)
или ЭДТА (2%) добавляют в шприц или бутыль в объеме 10%. Шприцы и флаконы
с антикоагулянтом необходимо охладить на льду. Немедленно после взятия
крови ее центрифугируют (2500 об/мин, 4 °С, 20 мин), предварительно
охладив ротор. Для получения сыворотки к плазме добавляют 2 мл 10%-ного
безводного СаС12 на каждые 10 мл цитрата или 1,6 мл 2%-ного раствора
хлорида кальция на
92
Глава 2
каждые 10 мл ЭДТА при перемешивании. Выдерживают несколько часов при 4
°С. Образовавшийся сгусток необходимо сжать для получения максимального
количества сыворотки. Последовательным замораживанием и оттаиванием можно
разрушить сгусток, ,затем его удаляют центрифугированием или
фильтрованием.
8. Предварительная оценка качества антисыворотки
Получение эффективных антисывороток определяется стратегией пробных
заборов крови после каждой инъекции, которые позволяют проследить за
возрастанием титра антител и изменением их специфичности и авидности. От
результатов, полученных в ходе этих пробных исследований, зависит
процедура последующих инъекций (время проведения, доза, использование
адъюванта, способ введения), а также выбор наиболее хорошо отвечающих
животных и необходимость в той или иной абсорбции.
"Золотое правило" при взятии проб крови - это включение^ систему
тестирования именно того метода, для осуществления которого данная
антисыворотка в конечном счете предназначается. Действительно,
антисыворотка может работать в методе Ухтерлони, но обладать слишком
малой специфичностью и (или) авидностью для осуществления радиоим-
мунологического анализа, для которого и была предназначена.
В табл. 1.2 (гл. 1) приведены разнообразные методы, используемые для
тестирования исследуемых антисывороток, (которые применяют в соответствии
с природой исследуемого антигена и предназначением получаемой
антисыворотки. В табл. 2.5 данные методы рассмотрены более подробно и в
соответствии с типом антигена. Подробное описание перечисленных методов
можно найти в гл. 6 и других разделах этой книги, а также в кн. 2.
9. Абсорбция антисывороток
9.1. Антисыворотки к отдельным антигенам в растворе
Большинство антиоывороток, предназначенных для изучения определенных
