Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 36

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 122 >> Следующая

вводят в/в 5 мг дезагрегированного (подвергнутого
ультрацентрифугированию) нормального кроличьего IgG непосредственно перед
инъекцией 100 мкг аффинно очищенных гомогенных кроличьих IgG к
углеродному антигену стрептококка в комплексе с ПАФ. В результате
супрессии преимущественно образуются антитела, специфичные к идиотипу
кроличьего антистрептококкового антитела.
6.7. Антисыворотки к эритроцитам барана
Иммунизация животных эритроцитами барана позволяет .продемонстрировать в
учебных целях кинетику и клеточные основы образования IgG и IgM, а также
получить практические навыки в постановке реакций агглютинации, обратного
гемолиза и титрования гемолизинов. Кроме того, использование эритроцитов,
нагруженных антиэритроцитарными антителами определенного изоти'па,
аллотипа и т. д., лежит в основе реакций гемагглютннации для выявления
антиглобулинов как одного из методов специфического тестирования и
титрования антиглобулиновых антисывороток.
Эритроциты барана получают из крови, взятой стерильно в антикоагулянт
(цитрат натрия - глюкоза). Порции крови по 20 мл центрифугируют (1500
об/мин, 20 мин), плазму и пленку лейкоцитов удаляют. Эритроциты отмывают
4 раза в 20 мл раствора Олсвера и ресуспендируют в том же объеме. Их
можно хранить в течение недели при 4 °С. Для иммунизации клетки дважды
отмывают в PBS и доводят их концентрацию до 10% (объем на объем) в том же
буфере, что соответствует примерно 109 клеток/мл.
6.7.1. Иммунизация мышей
Животным вводят в/в или в/б около 108 клеток (0,5 мл 2%-ной суспензии
эритроцитов). Через 5-6 дней после первой инъекции в сыворотке животных
выявляют главным об-
Получение поликлональных антител и контроль их качества
89
разом IgM. Повторные введения эритроцитов 2 раза в неделю (до 4 нед)
приводит к образованию преимущественно IgG. Лучше начинать бустерный курс
не ранее чем через 2 нед, когда снизится содержание IgG. Дозы могут быть
увеличены до 0,5 мл 10%-ной клеточной суспензии.
6.7.2. Иммунизация кроликов
Первая в/в инъекция 4-109 клеток (или 1 мл 10%-ной суспензии
эритроцитов/кг массы животного) приводит к образованию IgM через 5-6
дней. Далее можно провести интенсивный курс - около 10 инъекций: первые
четыре - ежедневно, остальные - через день. Повторные курсы с интервалами
в несколько месяцев обусловливают образование большого количества IgG,
обладающего агглютинирующей активностью. Получение эффективных сывороток
требует большого терпения.
6.8. Антисыворотки к мембранным антигенам клеток млекопитающих
Трудно получить поликлональные антисыворотки к ин-тактным ядерным клеткам
или экстрактам клеточных мембран (которые представляли бы ценность для
выявления дискретных антигенов клеточной поверхности) путем межвидовой
или внутривидовой иммунизации. За исключением особых случаев, касающихся
антигенов главного комплекса гистосовместимости и некоторых других важных
антигенов лимфоцитов, существующих в виде полиморфных или аллельных
систем, абсорбция полиспецифических сывороток для получения
удовлетворительных результатов обычно представляет большие трудности. В
литературе тем не менее имеются примеры успешного получения мышиных
сывороток данной специфичности [28].
Более подробно мы эту важную проблему не рассматриваем, поскольку обычные
методы, используемые для получения поликлональных антител к антигенам
клеточной поверхности, в настоящее время вытеснены методами гибридомной
технологии (гл. 3).
7. Получение и хранение сывороток
7.1. Сбор сыворотки
Кровь оставляют для свертывания при 37 °С на 1 ч. Сгусток отделяют от
стенок сосуда, и затем кровь оставляют на ночь при 4 СС для ретракции
сгустка. Сыворотку с минималь-
90
Глава 2
ным количеством эритроцитов переносят пипеткой в конические пробирки и
центрифугируют при 1500 об/мин 20 мин для удаления эритроцитов. При
необходимости на этой стадии добавляют консерванты. Образцы сывороток не
следует смешивать до проведения анализа (исключением может быть иногда
кровь, взятая у группы мышей). Из большого объема неисследованных
сывороток необходимо отобрать небольшие порции для последующего анализа.
Это позволяет избежать оттаивания всего объема сыворотки. Удобно закрытую
пробирку с пробной порцией приклеивать липкой лентой к стенке каждого
общего контейнера.
7.2. Контейнеры для хранения
Для хранения сыворотки лучше использовать полипропиленовые бутыли на ,50-
500 мл с завинчивающейся крышкой, поскольку стеклянные могут лопнуть при
замораживании; удобно использовать небольшие универсальные флаконы или
пробирки с крышками. Важно, чтобы каждый контейнер был герметичен. Не
следует использовать резиновые пробки, так как они повреждаются от ороза.
На контейнере необходимо отметить номер животного, его вид и дату взятия
крови. Пробы крови, отобранные последовательно, следует хранить вместе.
Не делайте надписи на стекле, так как они могут смываться при оттаивании.
Покрывайте надпись пленкой или используйте несмываемые чернила. Небольшие
Предыдущая << 1 .. 30 31 32 33 34 35 < 36 > 37 38 39 40 41 42 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed