Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 33

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 27 28 29 30 31 32 < 33 > 34 35 36 37 38 39 .. 122 >> Следующая

вводили 1 мг антигена в физиологическом растворе. Подобный режим был
использован и для получения антител к обработанным ультразвуком М.
tuberculosis и М. bovis
БЦЖ, но в качестве примирующей дозы вводили 200 мкг антигена в НАФ.
Эффективный способ разделения бактериальных белков и углеводов для
иммунизации, который применяют для обработанных ультразвуком
микобактерий, основан на способности углеводов спонтанно связываться с
эритроцитами барана, в то время как клетки, обработанные танниновой
кислотой, абсорбируют только белки. Отмытые эритроциты (3%-ная суспензия,
объем на объем), 10 мл, инкубируют при 37 °С с разведенным 1:100
обработанным ультразвуком анти-
Рис. 2.7. Двумерный ИЭФ позволяет продемонстрировать свойства
сбалансированной полиспецифической антисыворотки к белкам сыворотки
человека. Снимок любезно предоставлен д-ром A. R. Bradwell
5-997
82
Глава 2
геном в течение 2 ч, центрифугируют и повторно отмывают несколько раз.
Авторы используют метод Бойдена [35]:
1. К Ю мл 0,2 М PBS (pH 7,2) добавляют 0,25 мг танни-новой кислоты и
смешивают с 10 мл 3%-ной (объем на объем) суспензии эритроцитов барана.
Инкубируют смесь 10 мин при 37 °С.
2. Отмывают клетки один раз физиологическим раствором, центрифугируют и
ресуспендируют осадок в 0,5 мл обработанного ультразвуком супернатанта
БЦЖ-
3. Инкубируют смесь 2 ч (37 °С), затем добавляют 2 мл среды с Hepes,
центрифугируют и отмывают еще раз.
4. Окончательно ресуцпендируют клетки в 4 мл среды с Hepes, содержащей
0,1% БСА.
5. Иммунизируют мышь повторными введениями разбавленной в 3 раза
суспензией эритроцитов, нагруженных белками или углеводами (1 мл в/б).
6.3.3. Экстракты паразитов
Основным принципом получения преципитирующей антисыворотки с высоким
титром антител к поверхностным антигенам или тотальным экстрактам
гельминтов служит повторная иммунизация низкими дозами с ПАФ. Методы
получения экстрактов зависят от вида 'паразита [36]. Так, в случае
Schistosoma поверхностный антиген церкариев, 5-дневной легочной
шистозомулы и молодых и половозрелых особей может быть элюирован путем
медленного перемешивания в 4 М К.С1 в течение ночи при комнатной
температуре. После оттаивания супернатант центрифугируют (10 ООО об/мин,
4°С, 1 ч) и диализуют против PBS. Для получения тотальных экстрактов
паразитов обрабатывают ультразвуком (60 Вт и ток 0,8 А) в 4 мл PBS в
течение 3 циклов по 5 мин на ледяной бане с 5-мин интервалами для
охлаждения. Гомогенат центрифугируют (10 000 об/мин) и супернатант
используют как иммуноген.
¦ Кроликам и овцам вводят в/м 50-100 мкг белка с НАФ и второе в/м
введение проводят спустя 2 нед. Бустерные инъекции осуществляют п/к (50
мкг с ПАФ) с интервалами 3- 6 мес. Пробы крови забирают через 2 нед после
каждой инъекции. Рис. 2.2 иллюстрирует широкую специфичность
антисыворотки, полученной описанным способом к 5. mansoni (А) й
целесообразность использования вырезанных из пластин пиков преципитации
для получения моноспецифической антисы-вороткИ (Б).
Получение поликлональных антител и контроль их качества
83:
6.4. Антисыворотки к бактериальным суспензиям
6.4.1. Мыши
I. М. bovis БЦЖ. Антисыворотку с высоким титром антител к белкам оболочки
БЦЖ получают путем в/б инъекции
2-103 клеток микобактерий, введенных в НАФ, после которой через 30-
дневные интервалы вводят 104 клеток в физиологическом растворе в/б,
увеличивая дозу до 106. Для последующего слияния клеток селезенки с целью
получения гибридом последнюю инъекцию осуществляют за 4 дня до слияния.
(106 микобактерий).
II. В. pertusis. Мышам в/б вводят 1 раз в неделю 2-109 В. pertusis в виде
суспензии в 0,2 мл физиологического раствора. После четырех инъекций
можно сделать перерыв на 3 нед. Получение антител к В. petusis, главным
образом IgG2a'H30TH-па (ч2а), лежит в основе приготовления аллотипических
мы-шинных иммуноглобулинов, особенно для распознавания различий в локусах
Igh-1 "(2а-молекул (получение аллотипических антител см. в разд. 6.5.1).
В. pertussis, нагруженные мышиными антителами, могут быть использованы
для получения гетерологичных антисывороток к мышиному иммуноглобулину
(см. разд. 6.2.2).
6.4.2. Кролики
Кролики особенно широко используются для иммунизации убитыми бактериями.
Единственное серьезное исключение - суспензии микобактерий, которые
вызывают сильнейшие воспалительные процессы.
Могут быть успешно получены антисыворотки ко многим грамположительным и
грамотрицательным бактериям. Поскольку преимущественно образуются
серотипспецифические антитела (т. е. к углеводным структурам
липополисахаридов грамотрицательных микроорганизмов, характерных для
данного штамма), кроличьи сыворотки используют для серодиагностики.
Перекрестная абсорбция клетками других типов и видов не представляет
труда и позволяет удалить антитела к общим эпотипам белков наружной
мембраны.
Общим принципом использования бактериальных суспензий для иммунизации
следует считать в/в введение микроорганизмов в возрастающих дозах 1-2
Предыдущая << 1 .. 27 28 29 30 31 32 < 33 > 34 35 36 37 38 39 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed