Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 32

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 26 27 28 29 30 31 < 32 > 33 34 35 36 37 38 .. 122 >> Следующая

антисыворотки, специфичной к IgM. Подобный подход был применен для
выделения антител, специфичных к IgG, при использовании фракции
антиэритроцитар-ной сыворотки, богатой IgG. В этом случае контаминирую-
щие антитела к IgM абсорбировали суспензией клеток, нагруженных IgM.
Данный метод, как оказалось, приводит к преимущественному формированию
ответа на изотипспецифиче-ские эпитопы Fc-фрагмента Ig. Возможности
использования эритроцитов, нагруженных Ig соответствующего изотипа, для
абсорбции детально рассмотрены ниже (разд. 9.1.4, п. 4). Подход во многом
аналогичен тому, что используется для получения антител к аллотипам
гомологичных иммуноглобулинов у мышей и кроликов (см. разд. 6.5).
6.3. Антисыворотки к сложным смесям белков
Такие антисыворотки используются для изучения компонентов смеси
антигенов, а также как контрольные реагенты при определении
индивидуальных молекул. При получении таких антиоывороток важно достичь
максимального разнообразия иммунного ответа и такого баланса титров
антител с разной ¦специфичностью, чтобы при использовании одной
концентрации можно было выявить (в ИЭФ или двумерном ИЭФ) многочисленные
антигены, составляющие смесь. Применяя в качестве исходного материала
экстракт бактерий или паразитов, элюат клеточной мембраны или цельную
сыворотку, которые содержат антигены в разной концентрации и с различной
иммуногенностью, трудно получить сбалансированную антисыворотку,
выявляющую антигены небольшой мол. массы, поскольку преимущественно будут
образовываться антитела к 'большим молекулам. Может возникнуть
необходимость в раз-
80
Глава 2
делении смеси на фракции и использовании большого числа животных,
сыворотку которых затем смешивают в разных 'Пропорциях. Получение
сбалансированной ,'полиспецифической антисыворотки требует как терпения,
так и изобретательности.
6.3.1. Антитела к цельной сыворотке
Основная проблема использования цельной сыворотки или ¦плазмы в качестве
иммуногена заключается в получении эффективного ответа на а-глобулины.
Наилучший подход -
электрофоретическое разделение белков сыворотки на горизонтальной
пластине агарозного геля. Полосм геля затем можно разрезать поперек и
заморозить, и компоненты собирать в ходе оттаивания. После этого можно
иммунизировать овец различными фракциями в соответствии с их
электрофоретической подвижностью. Можно добавить антитела к отдельным
компонентам цельной сыворотки, например компонентам комплемента. На рис.
2.7 приведена электрофоре-грамма хорошо сбалансированной овечьей
антисыворотки к белкам сыворотки человека, полученной данным методом.
Общая схема иммунизации аналогична той, что рекомендована для отдельных
белков.
6.3.2. Бактериальные антигены
Существует много бпособов получения и экстрагирования бактериальных
антигенов [32]. От выбора способа так же, как от условий и фазы роста
бактериальной культуры, зависит природа иммуногена. Обработанные
ультразвуком экстракты бактериальных стенок представляют собой
чрезвычайно сложные смеси (см., например, рис. 2.4), и существует много
способов физического и химического фракционирования, для того чтобы
сделать исходный материал более однородным. Хорошим приметам служит
изучение антигенов микобактерий [33]. Полиспецифические антисыворотки
особенно полезны при определении молекулярных компонентов основных
фракций полисахаридов и белков по классификации Seibert [34].
По нашим данным, при иммунизации кроликов убитыми нагреванием или
облучением М. bovis БЦЖ, или М. tuberculosis, или порошком,
приготовленным из этих бактерий, и другими нерастворимыми бактериальными
препаратами с НАФ главным образом образуются антитела к поверхностным
белкам. Мы использовали 5-106 интактных организмов или 1 мг порошка в НАФ
для в/м введения, затем осуществляли подкожные инъекции повторно с
интервалом 3-6 мес для полу-
Получение поликлональных антител и контроль их качества
8f
чения соответствующей антисыворотки у кроликов. Для образования более
широкого спектра специфических антител необходимо использовать растворы
иммуногенов. Не существует стандартной смеси растворимых антигенов
микобактерий для иммунизации. Различными способами можно достичь
частичного фракционирования для получения основных белков, углеводов и
гликолипидов [32]. Для экстракции мембранного антигена используют тот же
метод, что и для Е. coli, т. е. озвучивание, обработку детергентом и
центрифугирование (см. разд. 3.3.2). 100 мкг белка повторно вводят с НАФ.
У кроликов аналогично получают антисыворотку к очищенной белковой фракции
туберкулина (PPD) М. tuberculosis. Основными белками PPD служат антигены
6 и 7 по номенклатуре Janic-ki [32].
У мыши развивается эффективный ответ на PPD. Антисыворотку с высоким
титром у животных, иммунизированных с целью получения гибридом, получали,
вводя в/б 50 мкг PPD с НАФ с бус-терными инъекциями на 30-й и 60-й день
(500 мкг с НАФ в/м); за 4 дня перед взятием клеток для слияния в/б
Предыдущая << 1 .. 26 27 28 29 30 31 < 32 > 33 34 35 36 37 38 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed