Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 31

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 122 >> Следующая

кроликов [18]
В случае применения слабых иммуногенов может возникнуть необходимость в
увеличении дозы премирующей и бус-терных инъекций. Удовлетворительные
антисыворотки для определения гликохолевой кислоты радиоиммунологическим
методом были получены путем введения конъюгата гаптена с БСА в ПАФ в/м по
5 мг ('первые две инъекции) и по 100 мкг конъюгата в ФР в/к (6 повторных
инъекций в течение 4 нед после 2 нед перерыва).
6.2. Образование антител к отдельным белкам
6.2.1. Мыши и крысы
Можно использовать ту же методику, что рекомендована для формирования
иммунного ответа на гаптен, применяя адсорбированные на квасцах белки и
убитые клетки В. pertussis. Для первой внутрибрюшинной инъекции мышам
желательно использовать 2-109 бактерий и 100 мкг адсорбированного белка в
равном объеме [28]. Если между примированием и бус-терным введением
,'пройдет два и более месяцев, то хороший гуморальный ответ достигается
при 'повторном введении 10 мкг одного иммуногена. При более коротких
интервалах могут потребоваться большие дозы.
6.2.2. Кролики
Для получения преципитирующей антисыворотки с высоким титром и
преобладанием IgG, например К гетерологично-му сывороточному белку, 100-
200 мкг белка эмульгируют в ПАФ и 0,5 мл вводят кролику тв/м в бедро.
Повторное введение проводят через 10-14 дней в другое бедро. Через 10
дней после второй инъекции можно взять пробу крови. Обычно для получения
антисыворотки с высоким титром необходимы бус-терные инъекции. Для этого
разработаны несколько режимов иммунизации, и все они предусматривают
период "отдыха" в течение 2-3 мес.
1. Подкожные введения белка с НАФ в несколько точек |(лучше в 6-8); общая
доза каждый раз 20-100 мкг.
2. Введение иммуногена с ПАФ подкожно в область плеча. По схемам (1) и
(2) получают эффективную кроличью антмсыворотку к IgG, IgA " IgM
человека.
78
Глава 2
3. Серии внутрикожных инъекций иммуногена в ФР (10 мкг в 0,1 мл).
4. Инъекции п/к 50-100 мкг белка в ФР.
После повторного введения через 1 нед у кролика следует взять пробу
крови. Это необходимо сделать и в том случае, когда после в/к инъекции
развивается сильная реакция Ар-тюса.
Эффективный метод получения кроличьей антисыворотки к мышиному
иммуноглобулину заключается в следующем:
1. Мышей иммунизируют еженедельно, вводя в/б суспензию 2 -109 убитых
клеток В. pertussis (курс состоит из 3-4 инъекций, его повторяют через 3
нед).
2. Иммунной сывороткой нагружают суспензию убитых клеток В. pertussis
(0,5 мл сыворотки на 10" бактерий в 10 мл), инкубируют 1 ч при 37 °С и
отмывают PBS.
3. Каждому кролику вводят по 4-109 микроорганизмов, нагруженных
антителами (IgG), в/в - 4 раза с недельными интервалами. Через 1 нед
после последнего введения берут пробу крови.
4. Иммунный ответ поддерживается повторными курсами спустя несколько
недель.
6.2.3. Овцы
Овцы хорошо отвечают на в/м и п/к введения 20-50 мкг очищенных
гетерологичных белков с ПАФ. Примировать можно 3-4-месячных ягнят.
Рекомендуем сделать перерыв на несколько месяцев, для того чтобы затем
получить наиболее эффективный ответ на бустерные инъекции, в ходе которых
вводят 250-500 мкг белка с ПАФ. Подкожные инъекции небольших объемов
белка дают такие же хорошие результаты, что и глубокие в/м инъекции, не
приводя к формированию больших гранулойатозных повреждений кожи. Пробы
крови берут через 1 нед после каждой бустерной инъекции. Такая методика
позволяет /получить антисыворотки с высоким титром к широкому спектру
гетерологичных сывороточных белков. Для получения антисыворотки к IgG
человека в качестве иммуногена используют очищенный Fc-фрагмент; это
позволяет избежать абсорбции для удаления антител к другим изотипам. Для
получения анти-IgA и анти-IgM антисывороток используют целые молекулы Ig,
так как последующая абсорбция для удаления антител к IgG не представляет
затруднений (см. разд. 9.1.6, п. 2).
Аналогичный подход можно использовать для получения антисывороток ко
многим антигенам, которые с целью очистки преципитируют в агарозе,
например с 'помощью овечьих ан-
Получение поликлональных антител и контроль их качества
79
тител. В этих случаях количество гетерологичного белка, вводимого
животному, гораздо меньше (измеряется нанограммами), и при соблюдении
длительных интервалов между бустер-ными введениями можно получить хороший
ответ.
Антисыворотки к иммуноглобулинам могут быть получены и без
предварительной очистки (см. разд. 3.2.3). Например, для получения
антисыворотки к кроличьему IgM 0,5 мл IgM-фракции свободной от
комплемента сыворотки к эритроцитам барана 10 мин перемешивали с 5 мл
10%-ной (объем на объем) суспензии эритроцитов. Затем эритроциты 5 раз
отмывали PBS, клетки смешивали с ПАФ и вводили в/м. Через 3 нед повторяли
введение в три разные точки, а спустя 7 дней в пробе крови методом ИЭФ с
антисывороткой к цельной кроличьей сыворотке выявили хороший ответ на
IgM. Истощение антител к легким цепям с помощью IgG обусловило получение
Предыдущая << 1 .. 25 26 27 28 29 30 < 31 > 32 33 34 35 36 37 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed