Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
шерсть на выбранном участке сбривают. Для расширения вен можно нанести на
кончик уха с помощью ваты небольшое количество ксилола. Участок кожи
обрабатывают спиртом, выше и ниже втирают вазелин. Концом остроконечного
скальпеля пересекают вену поперек и сдавливают ее выше разреза (со
стороны головы). Кровь собирают в небольшой стеклянный флакон, обычно
около 5 мл. Вату со спиртом мягко прижимают к месту разреза для'остановки
кровотечения; за это время ксилол полностью смывают с кончика уха 70%-ным
спиртом, а затем водой. После возвращения кролика в клетку за ним нужно
следить в
Получение поликлональных антител и контроль их качества
75
течение нескольких минут, чтобы убедиться, что при умывании животного
кровотечение не возобновилось. Полезно нанести на место разреза пленку
цианоакрилата.
5.2.5. Овцв
У овец кровь берут из наружной яремной вены с помощью техники
внутривенной инъекции. Иглой (30 мм, № 20) пунктируют вену по направлению
к голове и забирают 5-10 мл крови. ,
5.3. Взятие проб в ходе гуморального ответа и окончательный забор крови
5.3.1. Мыши, крысы и морские свинки
Животных обескровливают под эфирным наркозом (по методике забора проб
крови у крыс), морских свинок--после введения гипнорма. Лапки фиксируют
на доске липкой лентой. При работе с мышами используют 25-мм иглу № 23 и
шприц на 2 мл, крысами и морскими свинками-10-мл шприц и 40-мм иглу № 21.
5.3.2. Кролик
Для успешного взятия крови ее количество не должно превышать 20 мл (один
раз в неделю) или 50 мл (один раз в 2- 4 нед). Используют краевую вену
уха или центральную ушную артерию, которую пунктируют иглой-бабочкой с
канюлей. Кроликов можно успокаивать в/м введением гипнорма (0,5 мг/кг
веса). Окончательный забор крови проводят под анестезией путем сердечной
пункции. Кролику можно ввести гипнорм 2- 2,5 мг/кг или пентобарбитал
натрия (сагатал, 60 мг/мл, в/в). Для последнего обычно руководствуются
расчетом: 0,5 мл на кг веса, но кролики сильно варьируют по
чувствительности, поэтому лучше с помощью шприца на 3 мл ввести 1 мл
раствора, а затем вводить медленно препарат до потери корнеального
рефлекса. Пункцию сердца проводят, как описано для крыс, с помощью 50-мл
шприца, иглы диаметром 1,0 мм и нескольких 60-мл шприцев, или
трансфузионной иглы и катетера, соединенного со стерильным флаконом. От
взрослого кролика средних размеров может быть взято около 150 мл крови.
5.3.3. Овца
Из яремной вены у овцы с помощью системы для переливания крови получают
за один раз .500-700 мл крови,, которую можно собирать в антикоагулянт
(например, лимонцокис-
76
Глава 2
лую декстрозу) для получения плазмы. В другом случае позволяют крови
свернуться и на следующий день отделяют сыворотку. Кровь, собранную в
антикоагулянт, центрифугируют в пластиковых мешках при 4000 об/мин и
отделяют плазму. Такое количество крови можно получать от овцы несколько
раз (интервал 1 мес) при условии хорошего кормления животного. Если кровь
забирают более часто, то форменные элементы необходимо возвращать. Перед
взятием крови овце вводят 0,2 мл гепарина. 200 мл стерильного
физиологического раствора добавляют к осажденной клеточной взвеси в мешок
с антикоагулянтом и суспензию возвращают в наружную яремную вену через
капельницу в течение 5-10 мин. При этом овцу фиксируют в станке и вводят
транквилизатор (20 мг диазепама) .
6. Различные режимы иммунизации
6.1. Антитела к гаптенам
6.1.1. Формирование иммунного ответа на гаптены у мышей и крыс
Адсорбированный на квасцах конъюгат гаптена с белком (например, ДНФ-ГМФ
или оксазалон-ГМФ) в качестве при-мирующей инъекции вводят в/б (50 мкг
крысе или 30 мкг Мыши) вместе с 109 убитых клеток В. pertussis в 0,5 мл
физиологического раствора (ФР)- На 21-й день можно ввести .'повторно 30-
50 мкг одного только иммуногена в ФР (в/в - мышам и в/в - крысам). Кровь
тестируют на содержание антител через 4 дня и далее после бустерной
инъекции. Бустер-ные дозы можно вводить в/б; при интервале между ними
более 2 мес доза повторно вводимого иммуногена в ФР может быть уменьшена
до 10 мкг. Содержание антител достигает максимума к 6-7-му дню после
каждой бустерной инъекции.
6.1.2. Формирование иммунного ответа на гаптен у морских свинок
Белковый конъюгат (50 мкг), например ТНФ-БСА, эмульгируют в ПАФ и вводят
в мышцу бедра в общем объеме ,0,2 мл. Через 3-4 нед животных повторно
иммунизируют той же дозой иммуногена в НАФ п/к (0,2 мл) в различные
участки. Пробы крови берут через 2 нед.
6.1.3. Формирование иммунного ответа на гаптены (аминогликозиды] у
кроликов [16]
Конъюгаты гентамицина или амикацина с тиреоглобули-рвм или БСА
эмульгируют с ПАФ из расчета 1 мг конъюгата
Получение поликлональных антител и контроль их качества
77
в общем объеме 0,5 мл на введение одному кролику (по 0,25 мл в/м в оба
бедра). Повторно вводят 100 мкг конъюгата с ПАФ п/к с 2-месячными
интервалами.
6.1.4. Формирование иммунного ответа на гликохолевую кислоту у
