Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
Гейдель-бергер [4] показал, что способность антисывороток преципити-
ровать растворимые антигены, описанная Краусом [3] еще в 1897 г. на
примере культуральной жидкости Vibrio cholerae, представляет собой
количественную реакцию. Гейдельбергер разработал принцип количественной
оценки реакции преципитации и впервые получил чистый препарат антител.
Преципитация антигена, лежащая в основе многих современных мето-
12
Введение
дов иммунологического анализа,-это результат поливалентной специфичности
антисывороток. Антитела, содержащиеся в антисыворотке, связываются со
множеством антигенных детерминант на поверхности сложных антигенов, при
этом формируется пространственная решетка преципитата, который при
соответствующем соотношении концентраций антигена и антитела выпадает в
осадок. Несмотря на то что теоретические основы этой реакции были описаны
Марраком [5] еще в 1938 г., ее использование в простых методах
иммунологического анализа даже для изучения систем, содержащих один
антиген, было невозможно до 1946 г., когда Оудин [6] показал, что
диффузия антител и антигенов в жидкой фазе через поверхность раздела
соприкасающихся агаровых гелей позволяет оценить относительные
концентрации обоих компонентов реакции по расположению полос
преципитации. Диффундируя навстречу друг другу, антиген и антитело
формируют видимые комплексы в тех местах, где соотношение их концентраций
оптимально для образования преципитата. Это технологическое достижение
быстро привело к появлению метода двойной иммунодиффузии в геле, который
был разработан в 1948 г. одновременно Елеком [7] и Ухтерлони [8].
Благодаря данному методу впервые появилась возможность определения
антигенных взаимосвязей между молекулами, а также оценки специфичности
антисывороток. В 1953 г. Грабар и Уильямс [9] разработали технологию
иммуноэлектрофореза, а в 1965 г. Ман-чини, Карбонара и Хереманс [10] -
метод количественной радиальной иммунодиффузии.
Принцип совмещения электрофоретической миграции антигена в агаре с его
преципитацией под действием антител был развит в 1966 г. Лореллом [11],
который разработал метод ракетного иммуноэлектрофореза для быстрой оценки
количества индивидуальных антигенов в смеси с помощью моноспеци-фических
антител, введенных в гель, а также двумерный (перекрестный)
иммуноэлектрофорез, позволяющий оценить как качественный, так и
количественный состав сложной смеси антигенов с помощью полиспецифических
антисывороток.
Несмотря на то что методы преципитации в геле занимают значительное место
в изучении и количественном определении антигенов, а также широко
применяются для контроля специфичности и определения титра
преципитирующих антител, предел чувствительности данных методов
составляет около 5 мкг/мл, и их невозможно использовать для
количественного определения антигенов небольшой мол. массы, которые
образуют только нерастворимые комплексы. По этой причине возникла
необходимость в разработке альтернативных методов количественного
определения антигенов. В 1945 г. Кумбс и сотр.
Введение
13
[12] описали реакцию, при которой антисыворотка к иммуноглобулинам
человека агглютинирует эритроциты, которые связали соответствующие
иммуноглобулины. Помимо этой реакции, которая стала очень важным
клиническим тестом (ан-тиглобулиновый тест Кумбса), Кумбс также был
первым, кто использовал эритроциты как индикаторную систему в
иммунологическом анализе. Вскоре после разработки надежных способов
присоединения антигена к мембране эритроцитов были найдены чувствительные
методы на основе гемагглютинации, которые нашли очень широкое применение.
Вслед за этим было показано, что обусловленная антителами агглютинация
клеток, нагруженных антигеном, ингибируется в присутствии следовых
количеств конкурирующего свободного антигена. Это наблюдение привело к
созданию нового и очень чувствительного метода количественного
определения антигенов в растворе. В дальнейшем были разработаны и другие
методы, например реакция агглютинации эритроцитов, нагруженных
антителами.
Следующий этап в истории создания чувствительных методов
иммунологического анализа связан с открытием Фарром в 1958 г. [13] и
Яллоу и Берсоном в 1960 г. [14] технологии мечения антигенов, антител и
небольших пептидных гормонов радиоизотопами. Радиоиммунологический анализ
позволил определять чрезвычайно малые концентрации (вплоть до пмоль/л)
таких молекул, как инсулин, и выдвинул новые специальные требования к
технологии получения антисывороток. Для иммунизации животных стали
использоваться конъюгаты гаптенов (гормонов) с молекулами-носителями.
Именно этим способом удалось получить антитела с такой степенью
специфичности и аффинности, какая раньше никогда не требовалась.
В 1950 г. Кунс и Каплан [15] впервые применили для регистрации
взаимодействия антитела с антигеном связанную метку. Исследуя продукцию
антител и локализацию антигенов в лимфоидной ткани, они использовали
флуоресцеин - краситель, излучающий в ультрафиолетовой области спектра. В
