Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 12

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 6 7 8 9 10 11 < 12 > 13 14 15 16 17 18 .. 122 >> Следующая

ностью, а также специфичность. Первые (на которые оказывают влияние
различные адъюванты) зависят от достижения баланса между неограниченной
стимуляцией антиген-чувстви-тельных клеток в лимфоидных тканях животных
при условии персистирования иммуногена, с одной стороны, и от конкуренции
между клетками за лимитированное количество антигена таким образом, чтобы
отвечали лишь клетки с наибольшей аффинностью,- с другой. Специфичность
же критически зависит от чистоты иммуногена, поскольку даже небольшие
примеси могут вызвать непропорционально сильное антителообразо-вание.
Во многих реакциях используют преципитирующие свойства сывороток, а
поскольку они зависят от эффективного образования решетки между
антителами и несколькими антигенными детерминантами, то имеет значение не
только полиспецифичность, но и баланс титров антител. Всегда
предпочтительнее сыворотки, которые могут быть использованы в высоком
разведении, что позволяет снизить фон. В ракетном и двумерном
электрофорезе важно применять антитела, имеющие узкий изоэлектрический
диапазон в агаровом геле, и в этом случае необходим правильный выбор вида
иммунизируемого животного. Особенно хорошими свойствами с этой точки
зрения обладают IgGi овцы.
Если антисыворотки предполагается использовать в более чувствительных
количественных методах, например радиоим-
3-997
33
34
Глава 2
мунологическом или твердофазном иммуноферментном анализе, предъявляются
более высокие требования к авидности и специфичности. Антиглобулины
должны избирательно связываться с антигеном-мишенью - иммуноглобулином
определенного вида или конкретного изотипа данного вида, для чего
необходима тщательная абсорбция перекрестно реагирующих антител.
В большинстве случаев радиоиммунологический анализ используют для
определения незначительных концентраций небольших молекул. Для
иммунизации небольшие молекулы с низкой иммуногенностью необходимо
ковалентно связать с более крупными белковыми носителями, причем метод
связывания влияет на специфичность ответа. Может возникнуть необходимость
тестирования нескольких сывороток для того, чтобы выбрать наиболее
подходящую.
Получение сыворотки представляет собой лишь начальный этап приготовления
нужного реагента. Для большинства методов необходима лишь
иммуноглобулиновая фракция, остальные компоненты сыворотки могут быть
отброшены. Это приводит к снижению отношения общего белка к антителам,
уровня неспецифических реакций и к увеличению чувствительности метода.
Процесс мечения антител флуорохромом, ферментом или изотопом, а также
очистку методом аффинной хроматографии начинают с выделения
иммуноглобулинов.
После начальной проверки специфичности и титра этапы контроля качества
могут включать абсорбцию посторонних антител как альтернативу аффинной
хроматографии. Лучше всего ее осуществлять с помощью нерастворимых
антигенных полимеров или бус, поскольку жидкостная абсорбция приводит к
формированию растворимых иммунных комплексов с нежелательными свойствами.
Если титр и специфичность антител удовлетворительны, их можно
стандартизировать по отношению к данному антигену и окончательно
испытывать в широком спектре иммунологических методов, в которых они
могут найти применение. В табл. 2.1 обобщена стратегия получения антител
и контроля их качества.
2. Основные правила получения антител
2.1. Иммуноген
2.1.1. Небольшие молекулы
При использовании веществ с мол. массой менее 5-10 кДа необходимо их
ковалентное связывание с белком-носителем. В ответ на иммунизацию
образуются антитела и к детерми-
eg \Q cti codvp rn u *4 V?ffl iO"j О ffl t-' (C WC
Таблица 2.1. Стратегия получения антител и контроля их качества
1. Получение иммуногена (разд. 3 и 10)
а. Очистка
б. Проверка степени чистоты
в. В случае если мол. масса меньше 5-10 кДа - конъюгация с носителем.
2. Иммунизация (разд. 2, 4 и 6)
Выбор подходящего вида животного в качестве реципиента Выбор формы
представления антигена (т. е. с адъювантом или без него), способа
введения, дозы и сроков. Обеспечение возможно более длительных интервалов
между инъекциями (до нескольких месяцев)
Приготовление препарата иммуногеиа для инъекции (эмульсия, преципитат и
т. д.) в достаточном количестве.
Отбор проб и их тестирование (разд. 5, 8 и 9)
Пробное взятие крови и отделение сыворотки
Проверка специфичности, титра и аитигенсвязывающей активности, включая
метод, в котором предполагается использовать сыворотку Пробное истощение
сыворотки на основе выявленных перекрестных реакций и приготовление
нерастворимых сорбентов
Проверка истощенной сыворотки. При удовлетворительных результатах -
приготовление сорбентов для очистки большого объема сыворотки Определение
стратегии бустериых инъекций на основе собственных контрольных
исследований
При необходимости- повторение этапов а-г.
, Сбор, хранение и абсорбция сыворотки (разд. 5, 7 и 9)
. Сбор в течение длительного времени или путем забоя животного (зависит
от требуемого объема сыворотки)
Предыдущая << 1 .. 6 7 8 9 10 11 < 12 > 13 14 15 16 17 18 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed