Жизнь микробов в экстремальных условиях - Кашнер Д.
Скачать (прямая ссылка):
2. Регуляторные свойства ферментов экстремально галофильных бактерий
Регуляция ферментативной активности посредством аллосте-рических эффекторов и ингибиторов зависит от взаимодействий между субъединицами фермента. С регуляторными ферментами экстремальных (или других) галофилов до сих пор проведено лишь несколько исследований, но ни в одном из них не использовались высокоочищенные ферменты.
АТКаза Я. cutirubrum была одним из первых изученных в этом отношении ферментов (Liebl et al., 1969; Norberg et al.,
1973). Высокие концентрации соли необходимы как для активности этого фермента, так и для его регуляции. Максимальная активность и регуляция фермента, о которой судили по измерению ретроингибирования (ингибирования по принципу обратной связи) ферментативной активности под действием СТР, наблюдаются в присутствии 3 М соли. Как NaCl, так и КС1 приблизительно одинаково активируют фермент, однако ретро-ингибированйе в присутствии КС1 проявляется несколько отчетливее, чем в присутствии NaCl (Liebl, неопубликованные данные). Если концентрация соли падает ниже 2 М, активность фермента снижается, но его способность к ретроингибированию снижается еще сильнее, так что остаточная ферментативная активность подавляется СТР лишь в незначительной степени. Поведение АТКазы из дрожжей представляет собой практически «зеркальное изображение» активности фермента из Я. cutirubrum, поскольку максимальная активность и ретроингибирование (посредством UTP) первого из этих двух ферментов наблюдаются в отсутствие соли. Если концентрация соли повышается, активность АТКазы быстро снижается, а ее способность к ретроингибированию снижается еще быстрее. При концентрациях соли выше 1,0 М активность исчезает полностью (Liebl et al., 1969).
АТКаза из Я. cutirubrum была очищена лишь частично. Она очень нестабильна даже в 2,0 М растворе NaCl, и некоторые из
ей кинетических свойств изменяются с течением времени (Nor-bcrg et al., 1973), что препятствует попыткам определить, происходит ли потеря регуляторных свойств фермента при низких концентрациях солей в результате его диссоциации на каталитические субъединицы. Каталитическая и регуляторная активности ЛТКазы Я. cuiirubrum с трудом поддаются разделению. Нагревание при 50°С, которое позволяет разделить каталитические и регуляторные субъединицы дрожжевой АТКазы (Kaplan, Mes-snier, 1969) таким образом, что фермент утрачивает способность к ингибированию по принципу обратной связи до исчезновения его каталитической активности, оказывает на фермент из Я. си-iirubrum противоположный эффект. Другие воздействия, пригодные для мезофильных ферментов также не дают возможности разобщить каталитические и регуляторные свойства галофиль-ной АТКазы. Одиако обработка этого фермента полиэтиленгли-колем при высокой концентрации соли приводит к снижению его молекулярного веса от 160 000 до 34 000 (как установлено с помощью хроматографии на колонках с агарозой), по-видимому, в результате расщепления молекулы фермента на четыре субъединицы. Эти ннзкомолекулярные формы фермента более не ингибируются СТР. Полученные результаты позволяют предположить, что для данного фермента характерна такая же зависимость регуляции от субъедииичиой структуры, как и у ферментов из'более «нормальных» микроорганизмов. Другие случаи диссоциации мультисубъеднничных ферментов неионными растворенными веществами рассматриваются Брауном (Brown, 1976).
Либерман и Лани (Lieberman, Lanyi, 1972) нашли, что ADP, аллостерпческий эффектор треониндегидратазы (ТДазы) Я. cuti-ruhrum (фермент, участвующий в катаболизме треонина), сильно изменяет реакцию этого фермента на соль. В отсутствие ADP фермент проявляет активность в широком диапазоне концентраций NaCl (оптимум между 2 и 3 М); в присутствии же ADP этот фермент ингибируется NaCl. Малатдегидрогеназа Я. cutirubrum, играющая центральную роль в метаболизме, ингибируется аце-тил-СоА, NADH, оксалоацетатом и глиоксилатом. Эти ингибиторы, особенно NADH (Vidal, Cazzulo, 1976), в присутствии 3 М КС! были более эффективными, чем в присутствии 1 М NH4CI, хотя активность фермента в 1 М NH4C1 была вдвое выше (Cazzulo, Vidal, 1972). Было отмечено, что галофильная малатде-гндрогеиаза была сходна, за исключением ее потребности в соли, с соответствующими ферментами негалофильных организмов как по кинетическим, так и по регуляторным свойствам (Vidal, Cazzulo, 1976).
Цитратсинтазы грамотрицательных бактерий (мол. вес около 250 000) ингибируются низкой концентрацией NADH и реактивируются АМР. Тот же самый фермент из грамположительных
бактерий и эукариотических организмов (мол. вес около 80 000) не подвержен такому регуляторному контролю. Цитратсинтаза из Я. cutirubrum ингибируется лишь очень высокими концентрациями NADH, и это ингибирование сильнее выражено в присутствии 45 мМ MgCl2, чем в присутствии 2,6 М КС1, хотя каждая из этих солей обеспечивает максимальную активность фермента (Cazzulo, 1973). Таким образом, кажется маловероятным, что регуляция ферментативной активности посредством NADIi имеет для Я. cutirubrum физиологическое значение. Молекулярный вес данного фермента равен около 75 000; в этом отношении он напоминает цитратсинтазу эукариотических организмов и грампо-ложительных бактерий, а не фермент грамотрицательных бактерий. В дальнейшем цитратсинтаза Я. cutirubrum была получена в высокоочищенном состоянии (400-кратная очистка), хотя и не доведена до гомогенности (Higa, Cazzulo, 1975).
