Жизнь микробов в экстремальных условиях - Кашнер Д.
Скачать (прямая ссылка):
pH 7, если принять, что величины внутриклеточного и внешнего pH одинаковы. Экстраполируя эти данные, можно подсчитать, что в клетке алкалофильиого организма содержится 3,6-10~3 ионов водорода при соответствующем увеличении числа гидроксильных ионов. Вероятность того, что при этом вообще можно обнаружить ион водорода, составляет примерно 1 на 300. Напротив, при pH 2 ацидофил должен содержать 3,6* 105 ионов водорода. Однако допущение, что у кислото- и щелочелюбивых организмов внутриклеточный и внешний pH имеют одинаковую величину, чрезвычайно маловероятно. Такие резкие сдвиги в количестве внутриклеточных ионов водорода или гидроксила по сравнению с нейтральной реакцией среды, несомненно, вызывали бы глубокие биологические изменения в природе этих организмов.
1. Измерение внутриклеточного pH
Хотя понятие внутриклеточного pH не вполне ясно, этот показатель имеет определенную ценность, так как он дает представление об общих условиях, существующих внутри клетки. Однако фактическое измерение внутриклеточного pH затруднительно. В ряде исчерпывающих обзоров (Heilbrunn, 1952; Caldwell, 1956; Waddell, Bates, 1969; Rottenberg, 1975) детально описываются принципы и недостатки методов, пригодных для измерения внутриклеточного pH. Некоторые из этих методов включают использование микроэлектродов, измерение pH в лизатах разрушенных клеток или в извлеченной из клеток жидкости, применение индикаторов, таких, как бромфеноловый синий, а также измерение распределения между внешней и внутриклеточной средой проникающих рлабых кислот или оснований. Последний из перечисленных методов, применяемый для измерения внутреннего pH митохондрий и хлоропластов, по-видимому, может оказаться весьма полезным и для микроорганизмов. Принцип этого метода основан на способности таких слабых кислот, как 5,5-диметил-2,4-оксазолидиндион (ДМО; Waddell, Butler, 1959), или аминов, например метиламина или NH3+ (Rottenberg-et al., 1972a, b), проникать в нейтральной форме через мембраны. Исходя из определения внутренней и внешней концентраций проникающих молекул, рассчитывают величину pH (Rottenberg, 1975). Слабые кислоты проникают в пузырьки, имеющие внутри более щелочную реакцию, чем окружающая среда, а амины — в пузырьки, имеющие более кислую реакцию. Использование 14С-ДМО исчерпывающе детально описали Эдданки и Сотое (Addanki, Sotos, 1969). ДМО представляет собой слабую кислоту, метаболически инертную, нетоксичную, не способную связываться с белками или липидами и пассивно диффундирующую в нейтральной форме через многие биологические мембраны (But-
ler et al., 1966). ДМО был успешно применен для изучения трансмембранных градиентов pH, образуемых клетками Streptococcus faecalis (Harold et al., 1970). Кашкет и Вильсон (Kashket, Wilson, 1973) использовали 14С-метиламин для определения величин внутриклеточного-pH при изучении сопряженного с протонами накопления галактозидов у Streptococcus lactis. Основываясь на сходных принципах, Нил и др. (Neal et al., 1965) разработали методику определения внутриклеточного pH у дрожжей по поглощению и распределению 2,4-динитрофенола. Хотя-этот метод и пригоден для дрожжей, он, по-видимому, не найдет широкого' применения, поскольку 2,4-ДНФ является разобщителем окислительного фосфорилирования.
Несколько разработанных недавно методов, основанных па флуоресценции, в дальнейшем, вероятно, будут успешно использоваться для определения внутриклеточного pH. Шульдинер и др. (Schuldiner et al., 1972) ввели в практику применение флуоресцентного амина, 9-амииоакридпна. Величины внутриклеточного pH определяют, исходя из степени гашения флуоресценции в клетках, поглотивших молекулы этого вещества. В своем предварительном сообщений Томас и др. (Thomas et al., 1976) высказали предположение, что диацетат флуоресцеина может оказаться пригодным в качестве спектроскопического зонда для быстрого определения внутриклеточного pH. Диацетат флуоресцеина, который служит нефлуоресцирующим субстратом эстераз, при поглощении клетками превращается внутриклеточными ферментами в сильно флуоресцирующий флуоресцеии. Для определения используются исходные спектры поглощения и возбуждения флуоресцеина, обнаруживающие высокую чувствительность к pH. Данным методом, очевидно, можно пользоваться в диапазоне pH от 2 до 7. Применение этого метода к Bacillus acidocaldarius, выращенной при pH 3 и температуре 55°С, показало, что ее внутриклеточный pH равен 5,5; это достаточно хорошо согласуется с величиной pH 5,2—5,8, определенной с использованием ДМО.
2. Ацидофилы
Почти нет сомнений в том, что.внутриклеточный pH у ацидо-филов и алкалофилов не' соответствует pH внешней среды. Во многих сообщениях о ферментных системах, выделенных из этих организмов, показано, что их оптимум pH сильно отличается от pH внешней среды. Эти даные в целом рассматриваются как доказательство того, что внутриклеточный pH не равен наружному pH. Вплоть до самого последнего времени было проведено всего лишь несколько прямых определений внутриклеточного pH. Грубые определения обычно осуществлялись путем разрушения кле-
