Жизнь микробов в экстремальных условиях - Кашнер Д.
Скачать (прямая ссылка):
2. Термостабильность
Для оценки термостабильности кристаллического фермента из В. siearothermophilus (Amelunxen, 1966) кристаллы растворяли в деионизованной воде до концентрации белка 10—11 мг-мл-1. После нагревания этого раствора при 80°С в течение 10 мин инактивация даже в отсутствие цистеина была незначительной или вообще не могла быть обнаружена, и лишь при 90°С фермент инактивировался на 10%, что ясно свидетельствует о внутренней молекулярной термостабнлыюсти этого термофильного фермента. Напротив, такой же фермент, выделенный из мышц кролика, в аналогичных экспериментальных условиях в значительной степени инактивировался после нагревания при 70°С. К сожалению, температурный оптимум активности ГФДГ нз В. siearothermophilus не удалось определить нз-за нестабильности компонентов опытной смеси: в отсутствие фермента при температуре выше 60°С в смеси наблюдалось заметное увеличение поглощения света (Amelunxen, 1967). На графике Аррениуса было отмечено линейное возрастание ферментативной активности до температуры 55°С, а затем при 60°С кривая выходила на плато. Так как после внесения поправки па поглощение света нефермеитнымн компонентами смеси активность при 70°С сохранялась па том же уровне, перегиб кривой, возможно, был обусловлен нестабильностью компонентов опытной смеси. При тех же экспериментальных условиях скорость реакции, катализируемой ферментом из мышц кролика, начинала быстро снижаться при 40°С, а в интервале температур 50—60°С наблюдалась заметная инактивация фермента.
Описан способ кристаллизации термофильной ГФДГ после
удаления связанного с ней NAD+ (Amelunxen, Clark, 1970); термостабильность апофермента по существу оказалась такой же, как и термостабильность голофермента. Хокинг и Харрис (Hocking, Harris, 1973) сообщили, что период полужизии голофермента из Т. aqucilictis при 98°С превышает 30 мин и существенно не отличается от периода полужизни апофермента. Недавно опубликованы данные о том, что ГФДГ из В. stearothermophilus обладает значительно более низкой термостабилы-юстыо (Hocking, Harris, 1976), чем та, которую мы постоянно в течение многих лет наблюдали в нашей лаборатории, хотя количественное сравнение результатов, полученных в двух лабораториях, затруднено из-за различий в условиях экспериментов. В последнее время в кристаллическом состоянии была получена ГФДГ из Т. thermo philus НВ8 (Fujita et al., 1975), которая в результате нагревания при 90°С в течение 10 мин инактивировалась на 20% (концентрация белка 2,1 мг-мл-1 в буфере трис-НС1, pH 8,4-5). По сравнению с другими глицеральдегид-3-фосфат—дегидрогеназами выход фермента после двух перекристаллизаций был крайне низким и составлял 2,4%.
3. Физико-химические свойства
Гомогенность ГФДГ из В. stearothermophilus была доказана с помощью нескольких физико-химических методов (Amelunxen, 1966; Singleton et al., 1969; Amelunxen et al., 1966). В дальнейших исследованиях с применением электрофореза в полиакриламидном геле (в присутствии и в отсутствие ДСН) в перекри-сталлизованных препаратах фермента даже при такой высокой концентрации белка, как 200 мкг/гель, никаких примесей обнаружено не было (неопубликованные данные). Была также проверена гомогенность ферментов из Т. aquaticus (Hocking, Harris, 1973) и Т. thermophilus (Fujita et al., 1976).
Все выделенные до сих пор NAD-зависимые глицеральдегид-3-фосфат—дегидрогеназы, по-видимому, представляют собой тетрамерные белки с мол. весом около 144 000, состоящие из четырех идентичных субъединиц. При определении молекулярного веса фермента из В. stearothermophilus с помощью ультрацентрифуги методом седиментационного равновесия были получены следующие величины: 148700 в 0,1 М КС1 и 36 000± 120 в 5,0 М солянокислом гуанидине (Amelunxen et al., 1970). Величина S°2o,w для термофильного фермента составляет 7,17 (Singleton et al., 1969); это значение согласуется с данными для других глицеральдегид-3-фосфат—дегидрогеназ. Показано, что молекулярные веса ферментов из Т. aquaticus (Hocking, Harris, 1976) и Т. thermophilus (Fujita et al., 1976) равны соответственно 150 000
и 130 000—135 000 для нативных ферментов и 37 000 и 33 700 для их субъединиц.
Подобно ферменту из мышц кролика (Murdock, Коерре, 1964), фермент из В. stearothermophilus содержит 4 моля прочно связанного NAD+ иа 1 моль фермента (Singleton et al., 1969; Suzuki, Harris, 1971). По нашим сведениям, все выделенные гли-церальдегид-3-фосфат—дегидрогеназы, за исключением фермента дрожжей, содержат полный комплект связанного NAD+. Необратимая индуцируемая субстратом инактивация термофильной ГФДГ в присутствии NADIT (Amelunxen, 1967) сходна с инактивацией фермента из мышц кролика (Amelunxen, Grisolia, 1962), если не считать того, что она происходит при температуре, характерной для термофилов. Оптимальный для активности pH равен 10 (Amelunxen, 1967) в отличие от других глицеральдегид-3-фосфат—дегидрогеназ, имеющих оптимум pH в пределах 8,4— 8,6. Для фермента из Т. ihermophilus оптимальный pH равен 8,3 (Fujita et al., 1976).
