Жизнь микробов в экстремальных условиях - Кашнер Д.
Скачать (прямая ссылка):
1,2—1,3 раза (в соответствии с приведенными выше данными). Учитывая, что интервал между температурами выращивания составлял 18°С, трудно принять гипотезу о быстром ресинтезе макромолекул в качестве адекватного объяснения выживания этого организма при 55°С.
Имеющиеся данные не позволяют сделать однозначных выводов о роли быстрого ресинтеза макромолекул в определении термофилии. Получены убедительные доказательства того, что белоксинтезирующий аппарат и другие макромолекулы облигатных и кальдоактивных термофилов обнаруживают присущую им самим термостабильность. По-видимому, это также противоречит представлению о быстром ресинтезе макромолекул как о главном факторе, контролирующем рост термофилов. Вероятно, более удобной системой для изучения скоростей ресинтеза были бы кальдоактивные бактерии, которые имеют значительно более продолжительное время генерации, чем классический облигатный термофил В. stearothermophilus.
В. ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ МАКРОМОЛЕКУЛ
1. Введение
Результаты, представленные в обзорах и многочисленных работах, опубликованных в последнее время, показывают, что выделенные из термофильных организмов макромолекулы в общем обнаруживают большую «внутреннюю», т. е. присущую им самим, термостабильность, чем их аналоги из мезофилов. Такая повышенная термостабильность, очевидно, свойственна всем макромолекулам клетки, включая ферменты главных метаболических путей (табл. 6.1), ферредоксин (см. разд: 6, IV, Б), рибосомы (Ljungdahl, Sherod, 1976) и флагелии (Singleton, Amelun-xen, 1973). Хотя нам не встречалось никаких сообщений о свойствах мембранных белков или белков, связанных с ДНК, можно предполагать, что они также должны были бы обладать повышенной термостабильностью.
Необходимо отметить, что термостабильность белков не является уникальным свойством организмов, растущих при повышенных температурах. Классическим примером служит мио-киназа, которая, как было показано, сохраняет активность после нагревания при температуре 100°С (Colowick, Kalckar, 1943). У миоглобина температура перехода в денатурированное состояние составляет около 80°С, а у тетрамера авидина (Donovan, Ross, 1973) в отсутствие биотина 85ЧС, тогда как в его присутствии 132°С. У фосфофруктокиназ из С. pasteurianum и Е. coli температурный переход происходит приблизительно при 70 и 60°С соответственно (Case, Stellwagen, 1975). Следовательно, основ-
ное различие между белками мезофилов и термофилов заключается в том, что все белки термофилов должны функционировать при температурах развития этих организмов. Это означает, что в своих выводах о тех или иных различиях в свойствах белков мезофилов и термофилов исследователи должны проявлять осторожность, особенно в отношении тех белков из термофильных и мезофильных источников, которые существенно не различаются по термостабильности.
2. Измерение термостабильности
Так как большинство белков, выделенных из термофилов, относится к ферментам, термостабильность обычно изучают, измеряя сохранность их каталитической активности. Как правило, раствор фермента нагревают при разных температурах в течение определенного времени (5—10 мин), а при более длительной инкубации из раствора отбирают аликвотные пробы, в которых определяют активность при температуре, обеспечивающей стабильность фермента. Данные такого рода ясно показали, что белки термофилов более стабильны, чем их аналоги из мезофилов, однако этот вывод основан на изучении необратимого изменения белков и по существу ничего не говорит о причине их инактивации 1.
Определение температуры максимальной активности ферментов также указывает на их повышенную термостабильность, а потеря всей или большей части активности в результате превышения этой температуры на 10—15°С согласуется с представлением о денатурации белка. Однако все эти наблюдения не обязательно отражают термостабильность, присущую самому ферменту, так как субстраты и другие компоненты анализируемой пробы могут оказывать на белок стабилизирующее действие.
Кроме повышенной устойчивости к тепловой денатурации некоторые исследователи используют в качестве меры термостабильности белков значительную устойчивость их к денатурации такими соединениями, как мочевина, солянокислый гуанидин и додецилсульфат натрия. Но и в этом случае результаты исследований не содержат достаточной информации о причине повышенной стабильности фермента и не доказывают, что фермент устойчив при максимальной температуре роста соответствующего организма. Действительно, тщательное рассмотрение
1 Термин инактивация, а не денатурация следует использовать при описании утраты функции в том случае, когда отсутствуют измерения, показывающие, что произошла денатурация белка. Инактивация может быть обусловлена заменой функциональной группы, диссоциацией, небольшим коиформа-ционным изменением или денатурацией. Тенфорд (Tanford, 1968) определил денатурацию как «глубокую перестройку первоначальной нативной структуры белка без изменения его аминокислотной последовательности*.
данных такого рода свидетельствует об отсутствии однозначных доказательств того, что все белки термофилов обладают присущей им самим термостабилыюстыо при температуре выращивания термофилов, н особенно при максимальной температуре их роста (табл. 6.1). В качестве подхода к стандартизации методов оценки термостабильности мы предложили определять ферментативную активность после нагревания разбавленных растворов апоферментов (т. е. ферментов, свободных от кофакторов, субстратов, ионов и т. д.) в деионизованной воде или в очень разбавленном буфере в течение 5—10 мин при максимальной температуре роста данного организма. При этом мы исходим из предположения, что ферменты, обладающие присущей им самим термо-стабильностыо, должны сохранять при этой температуре по крайней мере 90% ферментативной активности. В идеальном случае было бы целесообразно оценить в аналогичных экспериментальных условиях также и поведение соответствующего гомологичного белка из мезофильпого источника.
