Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
пептида с трифторацетилом (ТФА). В ходе этой реакции образуется смесь, в
которой одни полипептидные молекулы присоединены к ТФА через е-
аминогруппы Lys 1 и Lys 7, а другие - также с помощью а-аминогруппы Lys
1.
На рис. 9.22 приведен спектр ЯМР связанного с ТФА S-пептида, в котором
ясно видиы три линии - К, L и М. Исследования модельных соединений
позволяют отнести линию L к ТФА, связанному с е-аминогруппой Lys 7, и к
моно-ТФА-Lys 1, а линии К и М - к дважды ацетилированному, по а- ие-
положениям, Lys *. В РНКазе S линия L расщепляется на две (L' и L").
Дальнейшие исследования показали, что линия L' отвечает ТФА, связанному с
е-аминогруппой Lys 7, a L" - е-аминогруппе монозамещенного Lys '. Таким
образом, ЯМР на 19 F оказывается достаточно чувствительным, чтобы
различить в модифицированном белке две е-аминогруппы, разделенные всего
несколькими остатками. Следует также отметить, что 19 F-меченные ферменты
сохраняют свою активность, т.е. их структура существенно не меняется.
Рис. 9.23 приводит спектры 19 F-меченной РНКазы S в присутствии и в
отсутствие различных ингибиторов. Линия L' смещается в сторону более
высоких полей и в некоторых случаях расщепляется на две компоненты. Мы не
будем здесь анализировать этот результат; отметим лишь, что как в этом,
так и в других примерах наблюдается высокая магнитная чувствительность
для 19 F, делающая его весьма полезным зондом.
11 Рибонуклеаза S (PHKa3aS)- это модифицированная форма рибонуклеазы А, в
которой разорвана пептидная связь между 20-м и 21-м остатками.
Образующиеся при этом два полипептида (остатки 1 -20 и 21 -124)
удерживаются вместе с помощью нековалентных связей. Первый из них
называется S-пептидом, а второй - S-белком. (Подробнее см. гл. 16.)
1Г
- 79,5 Гц Н >
РНКаза S
РИС. 9.22. Спектр ЯМР на I9F S-пепти-да, связанного с ТФА (вверху), и S-
пептида, связанного с S-белком (внизу). [Huest-is W.H., Raftery М.A.,
Biochemistry, 10, 1181 (1971).]
РИС. 9.23. Спектр ЯМР на 19F рибонук-леазы S, связанной с ТФА, в
отсутствие (вверху) и в присутствии различных ингибиторов. [Huestis W.H.,
Raftery М.А., Biochemistry, 10, 1181 (1971).]
ВВЕДЕНИЕ В МАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС
165
СПЕКТРЫ ЯМР НУКЛЕИНОВЫХ кислот
Метод протонного магнитного резонанса на уровне моно- и олигонуклеотидов
позволяет получить много ценной информации о таких особенностях строения
нуклеиновых кислот, как стэкинг и спаривание оснований, взаимная
ориентация оснований и сахаров и т.п. В случае полимеров с большой
молекулярной массой ситуация усложняется .тем, что нуклеиновые кислоты
состоят преимущественно из четырех нуклеотидных единиц, каждая из которых
встречается в молекуле много раз. Поэтому соответствующая часть спектра
представляет собой результат наложения сигналов от оснований данного
типа, расположенных на разных участках цепи. Кроме того, возникает
обычная для жестких макромолекул проблема значительного уширения линий.
Пуриновые и пиримидиновые основания содержат по два неспособных к обмену
протона, которые могут служить зондами. В пуринах это протоны Н-2 и Н-8,
а в пиримидинах - Н-5 и Н-6. Кроме того, имеются протоны метальной группы
тимидинового кольца.
В свободных мононуклеотидах химический сдвиг для протонов Н-2 и Н-8
пуриновых оснований в DzO составляет 8,4 - 9,0 м.д., для Н-5 пиримидинов
он равен от 6,3 до 6,6 м.д., для Н-6 - от 8,0 до 8,5 м.д., а для протонов
метальной группы тимидина - от 2,3 до 2,4 м.д. Таким образом,
необменивающимся протонам соответствуют ЯМР-сигиалы, лежащие в интервале
от 2 до 9 м.д.
Протоны, участвующие в образовании уотсон-криковских водородных связей,
не дают сигнала в D20, поскольку они замещаются на дейтерий. Для
регистрации ЯМР-спектров этих протонов используют неводные растворители.
На рис. 9.24. представлены спектры 1-метилцитозина, 9-этилгуанина и смеси
1:1 этих оснований в диметилсульфоксиде, полученные при рабочей частоте
60 МГц. В случае 1-метилцитозина протонам аминогруппы отвечает хорошо
разрешаемый пик; сигналы от Н-5 и Н-6 расщеплены до дублетов из-за спин-
спинового взаимодействия. ЯМР-сигналы, отвечающие протонам NH- и NH2-
rpynn 9-этилгуанина, достаточно далеко отстоят от сигнала Н-8. В спектре
смеси оснований ЯМР-сигналы, отвечающие протонам NHj-группы 1-
метилцитозина и NH- и NH2-группам 9-этилгуанина, сдвинуты в сторону более
слабых полей. Эти спектры свидетельствуют об образовании в растворе
уотсон-криковских пар оснований. Исследования, проведенные в неводных
растворах, указывают на образование пар А-Т и на отсутствие спаривания в
смесях G + Т и А + G.
О
Рибоэа
Аденозин
Гуанозин
О
Р.ибоэа
Цитидин
Деэоксирибоэя
Тимидин
Уридин
166
ГЛАВА 9
CNH2 С6 Н С5 Н
jiAjl
Гц относительно ТМС
РИС. 9.24. Спектры ЯМР 9-этилгуанина (G), 1-метилцитозина (С) и их смеси
в ди-метилсульфоксиде. Спектры сняты при рабочей частоте 60 МГц. [Shoup
R.R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 23, 194 (1966).]
м.д. относительно ДСС
РИС. 9.25. Спектры ЯМР протонов дрожжевой тРНКРЬе при 35°С, снятые при
