Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
различие. Например, линия, отвечающая С ", в пролине смещена относительно
стандарта иа 132 м.д., в аланине - на 142 м.д., а в глицине - на 150 м.д.
В этом отношении ЯМР на ядрах 13С существенно отличается от ЯМР на ядрах
1 Н, где для всех аминокислот резонансные линии отстоят друг от друга не
более чем на 8 м.д. Столь заметные различия в значениях химического
сдвига для 13С позволяют следить по отдельности за многими ядрами,
принадлежащими к различным аминокислотам. Другим преимуществом ЯМР на
ядрах 13 С (использующим необогащенные образцы) является фактическое
отсутствие спин-спинового взаимодействия между ядрами 13 С, поскольку в
большинстве случаев с ними соседствуют непарамагнитные 12С-ядра. Это
значительно упрощает спектр ЯМР.
Наконец,13 С- и 12 С-атомы настолько сходны, что 13 С может повсеместно
замещать обычный углерод. Таким образом, в отличие от специфически
связывающихся парамагнитных зондов, обладающих заметным объемом, замена
12 С на 13 С не искажает геометрии исследуемой молекулы.
Трудности, связанные с низким природным содержанием 13 С, можно обойти
путем обогащения образца этим изотопом. Имеется, однако, и другой
недостаток ЯМР на 13С, который несколько уменьшает потенциальные
возможности этого метода даже в тех случаях, когда удается получить
хорошие спектры. Несмотря иа большие различия в значениях химического
сдвига для 13 С по сравнению с 'Н, чувствительность этого параметра к
изменению окружения в случае 13 С значительно меньше. В результате
различия, например, между спектрами ЯМР на 13 С для денатурированных и
нативных белков оказываются менее выраженными, чем в случае спектров
протонного резонанса, что затрудняет исследование конформационных
изменений, взаимодействий с лигандами т.д. И все же в определенных
ситуациях ЯМР на 13 С обладает очевидными преимуществами. Например, если
надо проследить за превращениями определенного углеродного фрагмента в
ходе биохимического процесса, то удобно использовать изотоп 13 С, а
наблюдать за ним при помощи ЯМР.
За последние годы появилось несколько интересных работ по исследованию
белков с помощью спектроскопии ЯМР на 13С. Например, М. Ханкапиллар и др.
(Hankapillar M.W. et al., 1972) для изучения механизма ферментативного
катализа применили селективное обогащение 13 С по положению С-2
единственного гистидинового остатка в сери-новой а-литической протеазе.
Этот остаток входит в состав триады Asp-His-Ser, которая играет ключевую
роль при функционировании сериновых протеаз.
Иного рода исследование, использующее ЯМР на 13 С природного содержания,
предприняли К. Угурбил и др. (Ugurbil К. et al., 1977), которые сумели
разрешить и идентифицировать линии в ЯМР-спектре, отвечающие множеству
углеродных центров небольшого медьсодержащего белка азурина. [Для более
подробного ознакомления с другими применениями ЯМР на 13 С можно
обратиться к книге под редакцией Леви (Levy, 1976).]
ЯМР НА ЯДРАХ 31 Р
Магнитная чувствительность для 31 Р много меньше, чем для 1 Н или 19 F
(табл. 9.1), однако этот недостаток отчасти компенсируется тем, что
значения химического сдвига
ВВЕДЕНИЕ В МАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС
163
для 31 Р весьма велики - они лежат в диапазоне до 500 м.д. Кроме того, в
некоторых биологических объектах 31 Р присутствует обычно в меньших
количествах, чем 1 Н или 31 С, и расшифровка спектра несколько
облегчается благодаря меньшему числу линий в нем.
Некоторые работы по применению ЯМР на 31 Р уже выполнены, но еще больше
важных экспериментов предстоит провести. Одним из особенно интересных
исследований такого рода является изучение при помощи ЯМР на 31 Р
внутриклеточных фосфатов. Такие исследования представляются вполне
реальными, так как концентрация некоторых фосфатов в клетке (например,
АТР) достигает 1 мМ.
Примером может служить работа Р. Муна и Дж. Ричардса (Moon R.B., Richards
J.H., 1973), где ЯМР на 31 Р применялся для исследования 2,3-
дифосфоглицерата (ДФГ) в цельной крови кролика и в гемолизате. Обеим
фосфатным группам ДФГ отвечают хорошо разрешимые линии. Поскольку
значения химического сдвига для Р-2 и Р-3 зависят от состояния ионизации
соответствующих фосфатов, при помоши ЯМР удается определить pH внутри
клетки. Другим примером является исследование с помощью ЯМР на 31 Р
гликолиза и биоэнергетики анаэробных клеток E.coli (Ugurbil et al.,
1978).
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ I9F В КАЧЕСТВЕ ЗОНДА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ БИОХИМИЧЕСКИХ СИСТЕМ
При данном магнитном поле магнитная чувствительность для фтора близка к
чувствительности для 1 Н (табл. 9.1), а значения константы взаимодействия
и химического сдвига для ядер фтора значительно выше (в 10 раз и более),
чем для 1 Н. Кроме того, ядро атома 19 F обладает относительно малыми
размерами. Все это приводит к тому, что 19 F является по своим свойствам
идеальным специфически связывающимся зондом. Иллюстрацией этому может
служить исследование РНКазы S выполненное У. Хестисом и М. Рафтери (W.H.
Huestis, М.A. Raftery), которые изучали связывание Lys 1 и Lys 7 S-
