Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
денатурированной формы. Различия в положении и интенсивности линий
имеются и в области низких полей.
Ясно, что такие весьма существенные изменения в спектре связаны с
изменением магнитного окружения многих ядер в нативной структуре. Спектр
нативной формы, вообще говоря, очень информативен, но извлечь эту
информацию бывает трудно. В отдельных случаях удается идентифицировать
сигналы, отвечающие определенным остаткам, и проследить, как изменяются
их параметры при различных условиях. Это можно сделать, на-
160 ГЛАВА 9
РИС. 9.20. Спектр лизоцима в D20 (отложенные по оси абсцисс частоты
отнесены к частоте для стандартного соединения ДСС). А. Спектр,
построенный по данным об аминокислотном составе лизоцима. Б. Спектр
денатурированного лизоцима, полученный при рабочей частоте 220 МГц. В.
Спектр нативного лизоцима, полученный при рабочей частоте 220 МГц.
(McDonald С.С., Phillips W.D. In: Fine Structure of Proteins and Nucleic
Acids, ed. G.D.Fasman and S N.Timasheff, New York, Dekker, 1970, p. 1.)
пример, для боковых групп гистидиновых остатков, у которых С-2-протоны
обладают наибольшим химическим сдвигом по отношению к ДСС и четко
регистрируются. (В сво-
ВВЕДЕНИЕ В МАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС
161
РИС. 9.21. Спектр гистидиновых остатков рибонуклеазы А, снятый в DzO при
рабочей частоте 100 МГц. [Meadows D.H., Jardetzky О., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 61, 406 (1968).]
бодном гистидине химический сдвиг для С-2-протона равен 7,91 м.д., или
около - 1740 Гц в спектре, полученном при 220 МГц. Небольшой хорошо
разрешенный сигнал, отвечающий единственному гистидиновому остатку
лизоцима, ясно виден в спектре, приведенном на рис. 9.20, А.)
Рибонуклеаза А содержит четыре гистидиновых остатка (подробнее об этом
белке см. гл. 16). В нативном белке каждый из них имеет характерное
магнитное окружение, и соответствующие линии хорошо разрешаются при
рабочей частоте 100 МГц. Такой спектр представлен на рис. 9.21; сигналы
от С-2-протонов четырех гистидиновых остатков пронумерованы от 1 до 4.
Благодаря специальным экспериментальным подходам удалось соотнести все
четыре линии с определенными остатками белковой последовательности. Как
мы увидим позже (гл. 16), эта информация позволила значительно глубже
понять механизм действия фермента, поскольку два из этих четырех остатков
(His 12 и His 119) принимают непосредственное участие в каталитическом
акте.
Карбоксиметилирование либо His 12, либо His 119 приводит к одновременному
сдвигу ЯМР-сигиалов 2 и 3; при этом положение сигналов 1 и 4 остается
прежним. Следовательно, сигналы 2 и 3 отвечают остаткам His 12 и His |19.
Поскольку химическая модификация одного из гистидиновых остатков приводит
к смещению обоих сигналов, представляется вероятным, что эти два остатка
пространственно сближены (имеются данные, подтверждающие это
предположение). Для установления происхождения линии 2 была применена
специальная методика, основанная на водородном обмене (гл. 16).
Два других гистидиновых остатка - His 48 и His |05. Известно, что His 48
погружен в глубь белковой глобулы, поэтому линия 4 (с ее аномальными
положением и шириной), по-видимому, отвечает именно этому остатку.
Методом исключения получаем, что линия 1 соответствует остатку His 105.
Эти результаты согласуются также с данными водородного обмена,
приведенными в гл. 16.
Конечно, расшифровка ЯМР-спектра белка каждый раз представляет собой
самостоятельную задачу; соответственно и методы, используемые при этом,
могут различаться. Обычно для небольших белков известны и аминокислотная
последовательность, и те остатки, которые составляют активный центр,
поэтому удается идентифицировать одну или более линий из числа наиболее
хорошо разрешаемых. К тому же всегда можно упростить сложный спектр
выборочным дейтерированием определенных аминокислот. Такие
дейтерированные белки в случае бактерий получают, выращивая последние в
среде, которая содержит определенные 2 Н-аминокислоты.
13С-ЯМР-СПЕКТРЫ БЕЛКОВ
Природное содержание изотопа 13С составляет всего около 1,1% (см. табл.
9.1), а чувствительность регистрации - лишь 1,6% чувствительности для 'Н
(при одинаковом числе ядер и том же поле). Таким образом, ясно, что
интенсивность линий, отвечающих ядрам13 С, пример-
но
162 ГЛАВА 9
но в 104 раз меньше, чем в случае протонов. Тем не менее достоинства 13С-
ЯМР-спектро-скопии столь велики, что усилия, направленные на поиски
методов увеличения интенсивности 13С-линий, полностью себя оправдали.
Преимущества |3С-ЯМР обусловлены несколькими причинами. Во-первых,
значения химического сдвига для 13С расположены в гораздо более широком
диапазоне, чем в случае 'н. Так, линия, отвечающая карбонильному атому
углерода пептидной группы, смещена относительно стандартной линии для CS2
на 16 - 26 м.д. в сторону более высоких полей, для а-углеродных атомов
эта величина составляет 130 - 150 м.д., а для 5-углерода изолейцина -
около 180 м.д. Даже среди а-углеродных атомов наблюдается заметное
