Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
находившееся в момент времени t = 0 в состоянии А, через время t
останется в этом состоянии, есть е 7 А.) Резонансные частоты для
этих состояний равны соответственно ыА и шв. Когда тА > (шА - ыв)-1 и гв
(шА - - шв)-1, наблюдаются две четко различимые линии (рис. 9.19). При
выполнении этих условий "медленного обмена" время поперечной релаксации
отвечающее резонансу при частоте ы А, равно
158
ГЛАВА 9
(шА-ШВ)т"1
J L
(иА-ы")т=1
(ыА-шв)т=1/2
РИС. 9.19. Влияние обмена на спектр ЯМР. Ядра, которыми обмениваются два
центра, А и В, обладают характерными резонансными частотами ыд и ыв.
Предполагается, что заселенность обоих центров одинакова (х А = X в =
'/г) и тд = rR = т. (James T.L., Nuclear Magnetic Resonance in
Biochemistry, New York, Academic Press, 1975.)
= (T°Ar
' +ТД*
(9.43)
где Tja - время релаксации в отсутствие обмена. В подобной ситуации
влияние тА сводится просто к уменьшению величины Т2А и к уширению линии
при частоте ш А. Следовательно, при медленном обмене параметр тА (и
аналогично тв) можно получить, измерив уширение, вызванное обменом.
Когда скорость обмена такова, что ta < (шА - шв)_1итв < (шА - шв)-1,
наблюдается только одна линия (рис. 9.19). В этих условиях время
поперечной релаксации Т2, отвечающее этой единственной линии,
определяется как
Т2 1 = Za^a) 1 + ЫТ°2в) 1 + ?1хв(("а - wb)2(ta + тв)
(9.44)
где хА и Хв - относительное количество ядер, пребывающих в состояниях А и
В соответственно. В этой ситуации ширина единственной линнн зависит от
заселенностей каждого из состояний и от времен жизни тА и тв. Этот эффект
называется обменным ушире-нием. Оценить параметры тА и тв часто не
составляет большого труда. Например, если обмен протоном между молекулами
воды и этанола исследуется в водно-спиртовой смеси, относительная
заселенность каждого из состояний определяется просто как мольная доля
воды или спирта. Если рассматривается переход лиганда между свободным и
связанным состояниями, заселенности соответствующих состояний можно
найти, зная константу равновесия реакции присоединения лиганда.
Интересно отметить, что при тА и тв - 0 уравнение (9.44) приобретает вид
(9.45)
В этих условиях ширина единственной линии не зависит от времен жизни тА и
тв. Условия, при которых происходит слияние двух линий, могут быть при
определенных
ВВЕДЕНИЕ В МАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС
159
обстоятельствах использованы для определения тА и тв. Когда хл = Хд =
1/'2'та = гви
слияние двух линий отвечает условию
т = 2' 2(ыд - wB) '
где 2г = гА = тв и где предполагается также, что (7'5А)_1 = (7'5В)_' = 0.
Часто это соотношение оказывается весьма полезным.
9.6. Спектры ЯМР биологических систем
СПЕКТРЫ ПРОТОННОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА БЕЛКОВ
Молекулы небольших белков содержат - 103 протонов. В спектрах ЯМР
протонов боковых групп свободных аминокислот соответствующие линии обычно
отстоят друг от друга не более чем на 8 м.д. Например, линии ЯМР
метильной и метиленовой групп свободных аминокислот обычно смещены
относительно стандартного сигнала ДСС на величину от 0,8 до 3,5 м.д., в
то время как для протонов, связанных с атомами углерода в ароматических,
индольных и имидазольных кольцах, характерен сдвиг от 6,5 до 8,0 м.д.
Такое плотное расположение линий затрудняет их идентификацию. Как будет
видно из дальнейшего, одной из основных задач многих исследований
является упрощение спектров и идентификация сигналов, отвечающих
определенным остаткам, на фоне множества других сигналов.
Чтобы исключить многочисленные линии, отвечающие Н20, спектры ЯМР белков
обычно снимают в D20. При этом протоны, способные к обмену, замещаются
дейтерием и, следовательно, не дают резонансных сигналов. Чтобы все
протоны NH-групп заместились ядрами дейтерия, образец предварительно
прогревают в D20.
В первом приближении спектр белка можно получить суммированием спектров
отдельных боковых групп свободных аминокислот с учетом аминокислотного
состава белка. Такой спектр довольно близок к спектру денатурированной
белковой молекулы. Это сходство иллюстрирует рис. 9.20, где приведены
спектры лизоцима, полученные при рабочей частоте 220 МГц, и расчетный
спектр; последний обладает почти всеми характерными особенностями,
свойственными спектру денатурированного белка при 80°С. В обоих случаях
наблюдаемые линии лежат в пределах от - 150 до - 1800 Гц относительно
стандартного сигнала ДСС. Линии, отвечающие группам -СН2 и -СН3, лежат в
интервале от - 150 до - 750 Гц (- от 0,7 до 3,4 м.д.)., а для протонов,
связанных с атомами углерода ароматических, индольных и имидазольных
колец, резонанс наблюдается при частотах от - 1500 до - 1800 Гц (~ от 6,8
до 8,2 м.д.).
В отличие от беспорядочного клубка, спектр которого может быть получен
простым суммированием спектров составляющих аминокислот, для нативного
белка обычно характерен гораздо более сложный спектр (рис. 9.20, В).
Заметим, что в спектре нативного лизоцима имеются линии, расположенные
при частотах около - 100 Гц, которые отсутствуют в спектре
