Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
активные образцы обладают рядом свойств, среди которых наиболее удобным
для исследования является круговой дихроизм (КД), т.е. способность по-
разному поглощать лево- и правополяризованный свет. Существенное влияние
на КД оказывает взаимодействие между соседними хромофорами, которое
убывает с ростом расстояния между хромофорами приблизительно как Д-2 и
зависит от относительной ориентации хромофоров. Следовательно, КД
особенно чувствителен к типу вторичной структуры белков и нуклеиновых
кислот и протяженности структурных областей. Например, спектры КД а-
спирали, /3-слоя и беспорядочной конформации-четко различаются. Путем
подгонки спектров белков к затабулирован-ным спектрам полипептидов с
известной конформацией удается довольно надежно установить долю каждого
из типов вторичной структуры в данном белке.
Флуоресценция более чувствительна к окружению, чем поглощение, поскольку
процессы испускания охватывают сравнительно протяженный период времени.
Можно регистрировать стационарные спектры излучения либо исследовать
истинную кинетику затухания излучения. При достаточно близком
расположении двух хромофоров происходит перенос энергии. Возбуждая один
хромофор, можно наблюдать флуоресценцию другого. Вероятность переноса
обратно пропорциональна шестой степени расстояния между хромофорами.
Таким образом, измеряя эффективность переноса энергии, можно найти
расстояние между двумя характерными точками макромолекулы. При
пропускании через жесткие или замороженные образцы поляризованного света
наблюдается преимущественное поглощение хромофорами, обладающими
моментами переходов, ориентированными параллельно направлению
поляризации. В отсутствие молекулярного движения флуоресценция будет
иметь предельную поляризацию. Характерное время вращения молекул типичных
белков и нуклеиновых кислот в растворе составляет от 10 до 100 не, в то
время как время затухания флуоресценции лежит в интервале от 1 до 30 не.
Таким образом, наблюдаемая для растворов степень поляризации определяется
соотношением между временами затухания флуоресценции и молекулярного
вращения. При помощи поляризационных
124
ГЛАВА 8
измерений можно определять размер и форму макромолекул, а также
исследовать гибкость изучаемых структур.
Методами инфракрасной спектроскопии и спектроскопии комбинационного
рассеяния изучают молекулярные колебания. Поскольку эти колебания часто
бывают связаны с определенными группами атомов, данные методы в принципе
позволяют получать детальную информацию о структуре макромолекул.
Колебательные спектры поглощения, как и электронные спектры,
чувствительны к конформации молекул и к взаимодействию между соседними
хромофорами. Однако на практике эти методы используются реже других,
поскольку для измерений необходимы большие количества вещества;
исключение составляет новейшая лазерная спектроскопия комбинационного
рассеяния.
Задачи
8.1. Белок имеет три идентичных центра связывания, образующие
равносторонний треугольник. Если с одним из них связывается краситель
(донор), то измеряемый квантовый выход его флуоресценции (фа) составляет
0,5. Присоединение ко второму центру акцептора приводит к уменьшению 0D
до 0,25. Чему будет равен квантовый выход флуоресценции донора, если в
один центр поместить донор, а в два других - акцептор?
8.2. Степень анизотропии флуоресценции меченного красителем белка
измеряли сначала в зависимости от температуры при заданной вязкости (0,02
пуаза), а затем - при постоянной температуре (293 К) и переменной
вязкости. Получившиеся перреновские графики оказались различными (рис.
8.30). Объясните поведение экспериментальных кривых, а именно: различие
наклонов при высоких значениях Т/у, различия в величинах А 0, получаемых
с помощью линейной экстраполяции к значению Т/у = 0, и совпадение данных
при температурах ниже ~ 300 К.
8.3. Предположим, что мы хотим установить, одинаково ли расположены
основания в двух динуклеозидфосфатах, dApdA и гАргА. Однако оба
соединения существуют в виде равновесных смесей двух форм: в одной из них
основания расположены стопкообразно, в другой - нет. Константы равновесия
соответствующих переходов неизвестны и их непросто измерить, можно лишь
утверждать, что они различаются. Покажите, как путем измерения КД
мономеров и димеров можно прямо сравнить стопкообразные формы,
предполагая лишь, что спектр КД "нестопочной" формы в точности совпадает
с суммой КД изолированных мономеров.
8.4. Какая из следующих хромофорных пар будет иметь спектр КД, отличный
от спектра КД изолированных хромофоров?
а. Рис. 8.31,у4: все моменты переходов лежат в одной плоскости.
б. Рис. 8.31, Б1: все моменты переходов лежат в одной плоскости.
в. Рис. 8.31, В: m, и т2 равны нулю, /х, лежит в плоскости, параллельной
плоскости /х2, но расположенной выше.
г. Рис. 8.31,/': остальное так же, как на рис. В.
д. Рис. 8.31,Д: оба момента перехода расположены в одной плоскости,
остальное - как на рис. В.
