Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
стационарными и кинетическими измерениями флуоресценции. Значение тр,
определенное из уравнения (8.43), не зависит от концентрации, если мы
имеем дело с единственным и чистым компонентом, уравнение же (8.42)
справедливо только для оптически тонких слоев (поглощение при Хв меньше
чем 0,03). На практике при измерении зависимости интенсивности флу-
Номер канала (2,11 канала = 1,0 не)
РИС. 8.14. Затухание флуоресценции основания Y, входящего в состав
дрожжевой тРНКРЬе . Кривая / _ возбуждающий импульс. Кривая //,
проходящая через экспериментальные точки, построена теоретически, с
учетом формы возбуждающего импульса и в предположении, что заселенность
возбужденного синглетного состояния спадает по экспоненциальному закону с
одним характерным временем тр = 6,2 не. (С.R.Cantor, T.Tao. In:
Procedures in Nucleic Acid Research, vol. 2, New York, Harper and Row,
1971, p.31.)
ДРУГИЕ ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
93
оресценции от концентрации на приборе, аналогичном изображенному на рис.
8.13, при малых С интенсивность линейно зависит от концентрации, с
увеличением С происходит насыщение и, наконец, при достаточно больших С
F(X) начинает уменьшаться с ростом концентрации. Возникновение эффекта
внутреннего фильтра схематически представлено на рис. 8.13,Д. Весь свет
поглощается вблизи передней стенки кюветы, и большая часть потока
излучения, исходящего из этой области, не попадает на выходную щель.
СВОЙСТВА ТИПИЧНЫХ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ГРУПП
В табл. 8.2. представлены флуоресцентные характеристики хромофоров,
присутствующих в белках и нуклеиновых кислотах. Для большинства из них
характерны низкие квантовые выходы и малые времена жизни.
Экспериментальная чувствительность, которая определяется произведением на
г.тах [уравнение (8.42.)], низка. Это далеко не идеальные образцы для
экспериментальных измерений. На рис. 8.15 сравнивается флуоресценция
типичных белков и свободных аминокислот. Спектр флуоресценции большинства
белков определяется в основном флуоресценцией триптофана. Тирозин тоже
мог бы давать существенный вклад во флуоресценцию, поскольку этот
остаток, хотя и обладает более слабой флуоресценцией, обычно присутствует
в белках в большом количестве. Однако вследствие переноса энергии на
триптофан, о чем речь пойдет ниже, флуоресценция тиро-шновых остатков,
как правило, тушится.
Интенсивность флуоресценции обычных оснований нуклеиновых кислот очень
мала, хотя некоторые минорные основания (например, основание Y)
флуоресцируют достаточно сильно, что позволяет проводить рутинные
измерения. Слабость собственной флуоресценции оснований поначалу
обескураживала, но во многих случаях она обернулась благом. Один из
подходов к решению подобной проблемы состоит в присоединении к системе
флуоресцентной метки - интенсивно флуоресцирующего хромофора, который
специфически связывается с исследуемым объектом или ковалентно
присоединяется к нему.
Таблица 8.2.
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СОСТАВЛЯЮЩИХ БЕЛКОВ, НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И
КОФЕРМЕНТОВ
Вещество Условия Поглощение Флуоресценция О
Чувстви- тельность
X . max' нм е х max х 10_3 х max нм Гр, НС max F
Триптофан н20, pH 7 280 5,6 348 0,20 2,6 11
Тирозин Н20, pH 7 274 1,4 303 0,14 3,6 2,0
Фенилаланин Н20, pH 7 257 0,2 282 0,04 6,4 0,08
Основание Y Дрожжевая тРНКРЬе 320 1,3 460 0,07 6,3 0,91
Аденнн Н20, pH 7 260 13,4 321 2,6 • 10"4 <0,02 0,032
Г уанин Н20, pH 7 275 8,1 329 3,0 ¦ ю-4 <0,02 0,024
Цитозин Н20, pH 7 267 6,1 313 0,8 • 10"4 <0,02 0,005
Урацил Н20, pH 7 260 9,5 308 0,4 • 10"4 <0,02 0,004
NADH Н20, pH 7 340 6,2 470 0,019 0,40 1,2
Ч Для ф к приводятся максимальные из наблюдаемых значений. В каждом
данном случае действительные зна-чения могут быть существенно меньше.
94
ГЛАВА 8
Таблица 8.3
НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТКИ
Метка1* Поглощение Испускание2* Чувстве
телыюст
X . max НМ е х тая х 10~3 X . тая НМ ^F V НС ? А"х пк:я
F хЮ-2
Дансилхлорид Ковалентно присоединяется к остаткам белков Lys и Cys
330 3,4 510 0,1 13 3,4
1,5-I-AEDANS Ковалентно присоединяются к остаткам белков Lys и Cys
360 6,8 480 0,5 15 34
Флуоресцеин- изотиоцианат Ковалентно присоединяется к остатку белков
Lys 495 42 516 0,3 4 116
(F1TC)
8-анилино-1-нафтил сульфо- Нековалентно связывается с белками 374
6,8 454 0,98 16 67
нат (ANS)
Пирен и его производные Применяются при поляризационных измерениях на
больших системах 342 40 383 0,25 100 100
Этеноаденознн и его производные Аналоги нуклеотидов, связывающиеся с
белками и включающиеся в нуклеиновые кислоты 300 2,6 410 0,40 26
10
Бромистый этидий Нековалентно связывается с нуклеиновыми кислотами 515
3,8 600 ~ 1 26.5 38
Профлавинмо- иосемикарбазид Ковалентно присоединяется к З'-концу РНК
445 15 516 0,02 30
!* Структурные формулы этих соединений приведены на рис. 8.16.
2* Приведенные значения ф F и тр являются максимальными из тех данных,
которые были получены для биологических систем при комнатной температуре.
