Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
фотоумножитель, S - образец. Б. Изображение кюветного отделения в
увеличенном виде, иллюстрирующее эффект внутреннего фильтра.
При использовании простых однолучевых приборов типа представленного на
рис. 8.13 спектры возбуждения и флуоресценции могут быть искажены.
Искажение спектров возбуждения связано с неодинаковой интенсивностью
излучения лампы при разных длинах волн, а искажение спектров
флуоресценции обусловлено главным образом тем, что чувствительность
детектора зависит от частоты света. Чтобы устранить эти искажения,
потребовалось сконструировать гораздо более сложные спектрофлуориметры,
чем схематически представленный на рис. 8.13, хотя принцип их действия
остался прежним.
Величиной, чаще всего измеряемой при спектрофлуориметрических
исследованиях, является квантовый выход фр - доля молекул в возбужденном
синглетном состоянии, перешедших в основное состояние в результате
флуоресценции. Абсолютное измерение фр, как это будет видно из
дальнейшего, сопряжено с большими трудностями. Число возбужденных молекул
при интенсивности падающего света /0 пропорционально числу поглощенных
квантов. Эту величину, согласно закону Ламберта-Бэра, можно найти,
опреде-
ДРУГИЕ ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
лив при длине волны Хв уменьшение интенсивности света. Запишем уравнение
(7.33) в виде
/ = ]0?-2,зомхв)а
где ?(ХВ) - коэффициент экстинкции при длине волны возбуждения, С -
концентрация поглощающих молекул, / - длина оптического пути. При низкой
оптической плотности (это условие, как правило, выполняется при
флуоресцентных исследованиях) данное выражение можно представить в виде
I = /0[1 - 2,303е(Хв)С(]
Концентрация возбужденных молекул будет пропорциональна интенсивности
поглощенного света:
/0 - I = 2,303?(\JCII0
Интенсивность излучения молекулы при данной длине волны X определяется
произведением трех сомножителей: <t>Ff(X)d, где <j>F - суммарная
вероятность излучения, /(X) - доля светового потока, излучаемая при длине
волны X, d - доля светового потока при длине волны X, реально попадающая
на детектор.
Наблюдаемая в действительности интенсивность флуоресценции будет
определяться произведением вероятностей поглощения и излучения:
F(A) = 2,303x(Xb)C//o</>f f(j-)d = е(Х^фРД1)С10к (8.42)
Мы объединили в одну константу коэффициенты пропорциональности и
множители / и d, которые зависят от геометрии экспериментальной
установки. Интегрирование уравнения
(8.42) по X дает величину, пропорциональную числу молекул, перешедших
в возбужденное синглетное состояние. Но для определения квантового выхода
Ф? нам нужно знать также абсолютную интенсивность возбуждающего света /0
и константу к.
Чтобы обойти возникающие при этом трудности, измеряют относительный
квантовый выход, используя для калибровки прибора стандартные соединения,
например хинин-сульфат в 1 н. H2S04 (фь = 0,70) или флуоресцеин в 0,1
H.NaOH (фу = 0,93), и сравнивая интегральную интенсивность флуоресценции
(8.42) образца и стандарта (концентрации подбираются таким образом, чтобы
произведение еС в обоих случаях было одинаковым).
Другой подход к определению квантового выхода, основанный на
использовании уравнения (8.41), состоит в измерении скорости затухания
флуоресценции. Схема эксперимента выглядит следующим образом. Образец
облучают коротким (- 1 не) импульсом света и следят за затуханием
флуоресценции во времени. Интенсивность света /(f), излучаемого в момент
времени t после импульсного возбуждения, будет пропорциональна скорости
инактивации синглетного возбужденного состояния и доле молекул в
синглетном возбужденном состоянии, которые переходят в основное состояние
в результате флуоресценции:
Щ ос 0Frf(Sb)/A = (Бь(0))(фу/тДе-'^ = kF(Sb(0))e~'^ (8.43)
Здесь мы воспользовались выражением (8.39), чтобы найти d(Sb)/dt, и
выражениями (8.35) и (8.41), чтобы исключить ф? и tr. Хотя за кинетикой
затухания можно следить непосредственно, обычно для этого используют
косвенные методы. На рис. 8.14 показана типичная кривая, полученная
методом подсчета одиночных фотонов. Четко видна простая экспоненциальная
зависимость, описываемая уравнением (8.43).
Предположим, что образец содержит более одного флуоресцирующего
компонента. Теперь спектр флуоресценции будет зависеть от длины волны
возбуждения. Для смеси
92
ГЛАВА 8
двух компонентов (1 и 2)
^(¦л) = [ei(\)$1f/iMCi + ?2(^b)</>2f/2(^)^'2]^0^ (8.44)
где все величины имеют тот же смысл, что и в уравнении (8.42). Точно
так же спектр воз-
буждения не будет просто суммой двух спектров поглощения из-за наличия
весовых множителей, зависящих от квантового выхода, и зависимости
интенсивности флуоресценции каждого компонента,/,(Х) и/2(Х), от длины
волны. Если спектры флуоресценции компонентов перекрываются, то затухание
флуоресценции больше не будет описываться простой экспонентой:
/(f) = А,е~'riF + A2e~, T2F (8.45)
Амплитуды А, и А 2 будут пропорциональны концентрациям
соответствующих
компонентов.
Нельзя не обратить внимание на одно существеннее различие между
