Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
довольно редко. Чтобы увеличить интенсивность фосфоресценции, обычно
приходится использовать твердые стекла при низких температурах и по
возможности избавляться от кислорода. Поскольку такие условия, как
правило, неприемлемы для биологических систем, мы рассмотрим в основном
только флуоресцентные методы.
Из-за наличия безызлучательных процессов дезактивация возбужденного
синглетного состояния будет происходить быстрее, чем это можно ожидать
исходя из его радиационного времени жизни. Кинетическое уравнение,
описывающее убывание числа молекул в возбужденных синглетных состояниях
Sb(t), можно получить, проведя суммирование по всем параллельным путям
дезактивации:
- d(Sb)/dt = [kF + kic + kis + /c4(Q)](Sb) (8.38)
Решение этого уравнения имеет вид
(S|,(t)) = (Sb(0) )е -г/тр (8.39)
где (Sft(0)) - концентрация при I = О, 7F - наблюдаемое время затухания
флуоресценции
tf = [^f + kic + kis + /cq(Q)] 1 (8.40)
Сопоставляя величины rF, rR и фР, получаем
$f = tf/tr (8.41)
Поскольку в принципе tr можно найти из спектров поглощения, измерение
времени затухания флуоресценции (rF) равносильно измерению квантового
выхода (ф F).
До сих пор мы учитывали только один колебательный подуровень каждого из
состояний Sa и Sb. Рис. 8.12 иллюстрирует влияние на флуоресценцию других
электронных и колебательных уровней. Внутренняя конверсия между более
высокими синглетными состояниями, такими, как Sc и Sb, происходит гораздо
быстрее, чем процессы, которые мы рассматривали до сих пор. Аналогично
колебательная релаксация с более высоких колебательных подуровней каждого
электронного состояния на основной колебательный подуровень происходит до
испускания фотона. В результате все наблюдаемое излучение связано обычно
с переходом с нижнего колебательного подуровня самого низкого из
возбужденных синглетных состояний. Этот факт приводит к ряду важных
следствий.
1. Спектры флуоресценции не должны зависеть от длины волны возбуждения.
2. Большинство или все спектры флуоресценции сдвинуты в область более
низких энергий (в более длинноволновую область) относительно самой
длинноволновой полосы поглощения.
3. При условии, что системы колебательных подуровней состояний Sb и Sa
сходны, полоса флуоресценции будет близка по своей форме к зеркальному
отражению самой длинноволновой полосы поглощения (рис. 8.12)
Из рис. 8.12 видно, что переходы между нулевыми колебательными
подуровнями при поглощении [Sfl(v = 0) - Sb(v = 0), линия 1] и
флуоресценции [Sfc(v = 0) - Sa(v = 0), линия 1'] должны происходить при
одной и той же длине волны. В растворах обычно этого не наблюдается.
Поглощение осуществляется так быстро, что окружение молекулы можно
считать неизменным. Следовательно, переходу S0(v = 0) - Sb(v = 0)
соответствует разность энергий, при которой молекулы растворителя
находятся в выгодной ориентации
ДРУГИЕ ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
89
относительно поглощающей молекулы в основном состоянии. Если после
возбуждения молекулы растворителя успеют переориентироваться до момента
излучения, то переходу Sb(v = 0) - Sa(v = 0) будет соответствовать
разность энергий, при которой молекулы растворителя находятся в выгодной
ориентации относительно молекулы в возбужденном состоянии. Эти разности
совсем не обязательно должны быть одинаковыми, что приводит к сдвигу
частоты 0 - 0-переходов, называемому стоксовым сдвигом
МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ
На рис. 8.13 схематически изображена экспериментальная установка, обычно
применяемая для измерения флуоресценции. Эксперимент можно проводить
двумя способами. В первом случае при фиксированном положении
монохроматора М] поворачивают монохроматор эмиссии М2 и снимают спектр
флуоресценции - зависимость интенсивности света, излучаемого молекулой в
возбужденном синглетном состоянии, от длины волны. Во втором случае,
напротив, фиксируют положение монохроматора М2 и, поворачивая
монохроматор М,, снимают спектр возбуждения. Поскольку система успевает
перейти из всех состояний, лежащих по энергии в пределах и выше Sb, на
основной колебательный подуровень состояния Sb еще до излучения, спектр
возбуждения чистого вещества должен иметь ту же форму, что и спектр
поглощения.
8 7 6 5 4 3 2 1 Возбуждение
s,:
1' 2' 3' 4' Испускание
РИС. 8.12. Возбуждение и флуоресценция. А. Энергетические уровни. Б.
Спектры. Заметим, что в результате безызлучательных переходов переход нз
S2 в осуществляется гораздо быстрее, чем дезактивация с переходом из 5, в
основное состояние SQ.
Ч Обычно под стоксовым сдвигом понимают длинноволновый сдвиг максимума
флуоресценции относительно максимума поглощения. - Прим.ред.
90
ГЛАВА 8
Падающий
световой
Падающий
световой
Выходящий
световой
пучок
Концентрированный
раствор
Выходящий световой Разбавленный пучок раствор
Б
РИС. 8.13. Измерение флуоресценции в стационарных условиях. А.
Схематическое изображение флуоресцентного спектрометра. Mj - монохроматор
возбуждения, М2 - монохроматор эмиссии, L - источник света, РМ -
