Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
изолированная молекула, тем быстрее происходит излучение. Заметим,
однако, что уравнение (8.34) справедливо, только когда излучение
сопровождается переходом молекулы именно из того электронного состояния,
в которое она перешла при поглощении кванта. Это условие не всегда
выполняется. При более тщательном анализе наряду с электронными
переходами необходимо учитывать и колебательные. Экспериментально
наблюдаемое время жизни возбужденного синглетного состояния, как правило,
меньше радиационного времени жизни, определяемого из уравнения (8.34).
Это обусловлено потерей энергии возбуждения ие только из-за прямого
излучения света, но и в ходе множества других процессов (рис. 8.11). Мы
обсудим каждый из этих процессов более подробно, так как с их помощью в
принципе можно получить полезную информацию о свойствах биологических
систем.-
Когда вынужденным излучением можно пренебречь, собственно константу
скорости флуоресценции (kF) можно оценить, исходя из сказанного выше, как
кр = АЬа - 1/тк (8.35)
Безызлучательные процессы, конкурирующие с флуоресценцией, - это
внутренняя конверсия (к-к), интеркомбинациониая конверсия в триплетное
состояние (A:is) и различные процессы тушения флуоресценции [fcq (Q)].
Все эти процессы непосредственно конкурируют за дезактивацию возбужденных
молекул. Следовательно, доля возбужденных молекул, дезактивированных
посредством флуоресценции, которая называется квантовым выходом
флуоресценции фр, равна
фг = /cF/ [/cF + kIC + k-,s + /Сч(0)] (8.36)
Квантовый выход флуоресценции равен отношению числа излученных системой
фотонов к числу поглощенных фотонов.
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
Рассмотрим теперь подробнее факторы, влияющие на интенсивность
флуоресценции.
1. Внутренняя конверсия, характеризующаяся константой скорости Arjc. В
ходе этого процесса энергия возбуждения молекулы теряется при
столкновении с молекулами растворителя или рассеивается по внутренним
колебательным степеням свободы. Вообще говоря, kic растет с повышением
температуры, и, следовательно, наблюдаемая интенсивность флуоресценции
будет при этом уменьшаться. Для других спектроскопических явлений,
обсуждавшихся выше, такая собственная температурная зависимость
нехарактерна. Она может серьезно осложнить применение флуоресценции для
исследования конформа-
ДРУГИЕ ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
87
Колебательная
релаксация
РИС. 8.11. Пути перехода молекулы в возбужденное состояние и обратно.
(C.R.Cantor, T.Tao. In: Procedures in Nucleic Acid Research, vol.2, New
York, Harper and Row, 1971, p.31.)
ционных перестроек, которые происходят в макромолекулах при изменении
температуры.
2. Дезактивация в результате столкновений или образования комплексов с
растворенными молекулами (Q), приводящих к тушению флуоресценции,
характеризующаяся константой скорости A:q(Q). В отличие от всех других
процессов тушение при столкновении в принципе может представлять собой
бимолекулярную реакцию
S, + Q-^S,+ Q (8.37)
Поскольку Q всегда присутствует в избытке по сравнению с 5Ь, наблюдаемая
скорость дезактивации в действительности будет отвечать кинетике
псевдопервого порядка. Величину к можно получить путем измерения
зависимости квантового выхода флуоресценции Ф р от концентрации тушителя
Q. Радиационное время жизни ароматических хромофоров обычно лежит в
пределах от 1 ¦ 10"9 до 100 ¦ 10"9 с. Следовательно, тушение должно
весьма эффективно конкурировать с флуоресценцией. Почти каждое
столкновение таких часто используемых тушителей, как 02 и ион I ", с
находящейся в синглетном возбужденном состоянии молекулой приводит к ее
дезактивации. Частота столкновений лимитируется только диффузией и при
миллимолярных концентрациях тушителя иногда достигает 108 с~*, т.е.
тушение может быть весьма эффективным.
3. Интеркомбинационная конверсия с константой скорости Aris. При этом
происходит формально запрещенный переход с изменением спина из
возбужденного синглетного состояния в возбужденное триплетное. Из этого
состояния молекула может перейти в основное синглетное состояние (S0)
либо путем фосфоресценции (испускание фотона), либо безызлучательным
путем. Триплетное состояние обычно ниже по энергии возбужденного
синглетного состояния. Следовательно, спектр фосфоресценции сдвинут в
более длинноволновую область и его легко отличить от спектра
флуоресценции.
Вероятность прямого перехода из основного синглетного состояния в
возбужденное триплетное чрезвычайно мала. Поэтому триплетные состояния
выявляются лишь при излучении. Другим следствием малой интенсивности
поглощения является чрезвычайно большое радиационное время жизни молекулы
в триплетном состоянии: это время дости-
88
ГЛАВА 8
гает секунд и более, в то время как для синглетных состояний характерны
времена порядка наносекунд. Это означает, что столкновение с тушителями
или внутренняя конверсия смогут весьма эффективно конкурировать с
фосфоресценцией. Именно поэтому фосфоресценция в растворах наблюдается
