Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
используется свет с круговой поляризацией, а весь излученный свет удается
регистрировать. Поскольку интенсивность излучения пропорциональна
количеству поглощенного света, разность интенсивностей излучения,
отвечающих возбуждению при помощи лево- и правополяризованного света,
будет давать разностный спектр поглощения (в данном случае - КД) только
флуоресцирующих хромофоров. Так, например, если молекула белка содержит
два остатка триптофана, из которых лишь один является флуоресцирующим,
обычный КД будет просто суммой КД обоих этих остатков. КД, регистрируемый
по флуоресценции, будет относиться только к одному из остатков
триптофана; КД другого можно найти путем вычитания. Для возбуждения можно
использовать неполяризованный свет, но измерять разность интенсивностей
лево- и правополяризованного излучаемого света. Такой подход позволяет
получить КД хромофора, отвечающий его конфигурации в возбужденном
состоянии, в отличие от всех прочих методов измерения КД, регистрирующих
конфигурации основного состояния (см. Steinberg, 1978).
Наконец, упомянем о КД в инфракрасной области. Этот метод пока только
разрабатывается, но со временем он обещает превратиться в новое средство
получения информации о структуре больших и малых молекул.
8.2. Флуоресцентная спектроскопия
При испускании света молекулами проявляются совершенно другие их
свойства, чем при поглощении. Процессы испускания охватывают сравнительно
протяженный период времени. За это время в системе успевает произойти
целый ряд перестроек и взаимодействий, влияющих на спектры флуоресценции.
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
Рассмотрим гипотетическую молекулу с двумя энергетическими уровнями Sa и
Sb:
ДРУГИЕ ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
85
В разд. 7.1 мы показали, что свет с плотностью излучения/(v) вызывает
переход с уровня Sa на уровень Sb со скоростью ВаЬ на молекулу. Обратный
процесс Sb - Sa происходит с той же самой скоростью; таким образом, ВаЬ =
ВЬа. Пусть в исходной системе па молекул находятся в состоянии Sa и пь в
состоянии Sb. Тогда скорости соответствующих переходов равны nJBalJ(v) и
nbBbJ(v). В равновесии эти скорости должны быть одинаковы, т.е.
nJBatj[{v) = nbBbJ(v) и па = пь независимо от плотности света. Мы
получили абсурдный результат. В отсутствие возбуждающего света все
молекулы должны, очевидно, находиться в основном состоянии Sa. При низких
интенсивностях па и пь едва ли будут отклоняться от равновесных значений.
Эти значения можно найти из статистической механики. В отсутствие
вырождения экспоненциальный больцмановский множитель имеет вид
па/пь = е <в" Eb)lkT = e+h'lkT (8.27)
где h - постоянная Планка.
Первым, кто указал, что противоречие разрешается, если ввести понятие о
скорости спонтанного испускания фотона из состояния Sb, был Альберт
Эйнштейн. Скорость этого процесса (АЬа) не должна зависеть от I(v).
Учитывая спонтанное излучение, запишем условие равновесия в виде
равенства скоростей прямого и обратного переходов между состояниями S" и
Sh:
njnb = [BbJ(v) + Aba]/BabI(v) = 1 + AJBahI(v)
(8.28)
Приравнивая правые части выражений (8.27) и (8.28), мы можем найти АЬа.
Для этого вначале введем величину плотности излучения абсолютно черного
тела при температу-ре Т'.
I{v) = &7ihv3/c3{eh'lkT - 1) (8.29)
Подставляя это выражение в уравнение (8.28), находим
njnb = 1 + AjBabI(v) = 1 + Aba(eh'lkT - l)/%nhvic~iBah (8.30)
Приравняв правые части выражений (8.27) и (8.30), мы получим
Aba = 8nhv3c-3Bab (8.31)
Отметим, что АЬа зависит от частоты в третьей степени. Это означает, что
при малых длинах волн АЬа много больше, чем ВаЬ. Существенно, что все
излучение является спонтанным. Ранее [уравнение (7.29)] мы показали, что
Bab = (2ir/3fi2)Dab. Таким образом,
АЬя = (32л3у3/3 c3h)Dab (8.32)
Плотности излучения и поглощения в условиях равновесия должны совпадать.
Плотность излучения объекта, находящегося в равновесии при температуре Т,
описывается уравнением (8.29).
[cm.R.P.Feynman, R.B.Leighton, M.Sa.iJs, The Feynman Lectures on Physics,
vol. 1, Reading, Mass., Addison-Wesley, 1963, chaps. 41-42. Имеется
перевод: Фейнман P., Лейтон P., Сэндс М. Фейнманов-ские лекции по физике.
- М.:Мир, 1966.]
86
ГЛАВА 8
Так как силу диполя (Dab) и частоту (г) обычно можно найти из
спектров поглощения,
скорость спонтанного излучения удается определить, не регистрируя
само излучение. В
отсутствие облучения или каких-либо других возмущений или взаимодействий
скорость дезактивации молекулы, изначально находившейся в состоянии Sb,
будет равна
dnjdt = -Abanb (8.33)
Решением этого дифференциального уравнения является функцияnb(t) =
nb(0)e~Abat, где пь(0) - концентрация молекул в возбужденном состоянии
при t = 0. Таким образом, мы можем определить радиационное время жизни
для состояния Sb как
tr = 1 /Аьа (8.34)
Сила диполя Dab непосредственно связана с интенсивностью поглощения. Из
уравнения (8.32) следует, что Dab иАЬа пропорциональны. Таким образом,
уравнение (8.34) показывает, что чем сильнее поглощает данная
