Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
исследованы несколько изоморфных производных. Изоморфное замещение было
проведено для оценки фаз всех Fp(h, к, /) и после использования этих фаз
и всех прочих данных - для расчета (с определенным разрешением) карты
электронной плотности. Выбранное разрешение будет зависеть от качества
реального кристалла и степени изоморфности производных.
РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ
397
Улучшение разрешения сопряжено с существенным увеличением набора
экспериментальных данных, и для того, чтобы затраченные усилия не пропали
даром, значения фаз должны быть очень надежными.
Бели в результате расчета получается карта с разрешением около 6 А, то
макромолекула предстает на ней обыкновенно в виде сгустков электронной
плотности; типичный пример приведен на рис. 13.39,.4. При этом разрешении
обычно невозможно распознать скелет полимерной цепи белка или нуклеиновой
кислоты.
Однако даже при разрешении 6 А в карте электронной плотности содержится
очень полезная информация. Можно получить представление о деталях формы
макромолекулы, различить отдельные субъединицы или пустоты в структуре;
так, а-спирали предстанут в виде отдельных стержней. При наличии
помеченных тяжелым атомом лигандов или субстратов можно с помощью
разностного синтеза Фурье определить места их связывания. Бели найденные
результаты окажутся разумными, то обычно стоит перейти к анализу с более
высоким разрешением при условии, конечно, что экспериментальные данные,
полученные при исследовании имеющихся производных, обладают достаточно
высоким качеством.
При разрешении 3 А уже можно увидеть скелет полимерной цепи (рис.
13.39,В). В случае белка боковые группы только достаточно крупных
аминокислот проявляются как дискретные пики электронной плотности. При
таком разрешении еще трудно сконструировать осмысленную модель молекулы.
Но в случае нуклеиновых кислот двойные спирали проявляются довольно
отчетливо.
При разрешении 2,5 А видны почти все боковые группы белковой молекулы.
Карбонильная группа каждого пептида имеет вид выступа на основной цепи,
так что можно определить ориентацию каждой пептидной плоскости.
Если известна последовательность аминокислот, можно начинать строить
модель белка. Для этого существуют разные методы. В простейшем из них
используется Ричард-бокс, где с помощью полупрозрачного зеркала
изображение проволочной модели совмещается со сложенными стопкой
сечениями электронной плотности, нарисованными на тонких пластинах
оргстекла. Затем с модели считываются координаты атомов. В новейших
методах используется машинный поиск, когда пептидную цепь "подстраивают"
под наиболее вероятный непрерывный ход электронной плотности. Заметим,
что при обоих подходах существенным образом используется предположение,
что геометрия пептидной цепи (за исключением двугранных углов) известна.
Это сильно отличается от рентгеноструктурного анализа малых молекул с
высоким разрешением, где длины валентных связей и валентные углы
определяются de novo.
Первоначальная подгонка пептидной цепи к карте электронной плотности с
разрешением 2,5-3,0 А не будет очень точной. Многие группы не совпадают в
точности с пиками электронной плотности, которые предположительно их
представляют (см. типичный пример на рис. 13.39,В). Однако
предварительную модель можно теперь использовать в одном или нескольких
циклах уточнения. Например, при уточнении в прямом пространстве модель
подгоняют таким образом, чтобы попытаться минимизировать разницу между
плотностью р (х, у, г), вычисленной по рентгеновским данным, и
плотностью, рассчитанной для модели. Кроме того, можно воспользоваться
методом фурье-уточнения или методом наименьших квадратов.
При более высоком разрешении начинают просматриваться отдельные атомы
(см., на-пример, карту с разрешением 1,5 А на рис. 13,39,/''). Теперь уже
действительно можно идентифицировать боковые группы многих аминокислот
прямо по карте электронной плотности. В самом деле, структурно-
кристаллографические исследования выявили ряд серьезных ошибок в
предшествующих определениях аминокислотных последовательностей. Чем
больше боковых групп удастся увидеть, тем более точную модель можно по-
398
ГЛАВА 13
строить и в свою очередь тем вероятнее, что дополнительное уточнение
карты электронной плотности приведет к дальнейшим улучшениям.
УЧЕТ ЭНЕРГИИ БЕЛКОВЫХ КОНФОРМАЦИЙ ПРИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ КАРТЫ ЭЛЕКТРОННОЙ
ПЛОТНОСТИ
Кристаллографы серьезно озабочены вопросом, насколько данные
конформационного анализа белков могут быть использованы в процессе
определения кристаллических структур. Как показано в гл. S, мы с
достаточной уверенностью можем судить, какие области двугранных углов
чаще всего встречаются у пептидов. Нам многое известно о силах, которые
определяют взаимодействия валентно-несвязанных остатков. При данной
пробной структуре, определенной с помощью фурье-синтеза, знание этих
конформационных свойств можно было бы использовать - путем минимизации
энергии - для расчета структуры, лучше согласующейся с известной нам
