Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
которая в большинстве методов считается недопустимой. Вероятно, будет
справедливым сказать, что количество рентгеновских данных компенсирует
недостаток качества отдельных экспериментальных точек.
13.5. Определение структуры макромолекулы
МЕТОД МНОЖЕСТВЕННЫХ ИЗОМОРФНЫХ ЗАМЕЩЕНИЙ
Методы, описанные выше для малых молекул, не приводят к успеху при работе
с белками и нуклеиновыми кислотами. Эти большие молекулы в общем случае
не содержат удобно расположенных тяжелых атомов. Даже если такие атомы и
попадаются, все равно сложность структуры требует иных подходов для ее
определения. Типичное кристаллографическое исследование макромолекул
состоит из следующих этапов:
1. Сначала пытаются вырастить подходящие кристаллы нативной
макромолекулы. (В кристаллографии белков и нуклеиновых кислот этот этап
самый трудный и требует к тому же больших временных затрат. Во многих
случаях образуются макромолекулярные кристаллы, совершенные
морфологически, но степень беспорядка в них столь велика, что невозможно
получить дифракционные данные высокого разрешения.) Используя выращенные
кристаллы, определяют пространственную группу симметрии, размеры
элементарной ячейки, а затем получают набор данных об амплитудах
рассеяния.
2. На этом этапе пытаются получить несколько изоморфных производных,
содержащих тяжелые атомы (тяжелоатомных изоморфных производных). Они
представляют собой кристаллы с такими же элементарной ячейкой,
пространственной группой и макромолекулярной структурой, что и исходный
кристалл, только в специальные положения введен один или несколько
РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ 379
тяжелых атомов. Для каждого производного получают новый набор данных об
амплитудах рассеяния.
3. Теперь пытаются определить положения тяжелых атомов в кристалле.
Распространенный способ сделать это - построить карту разностного
изоморфного паттерсоновского синтеза (см. ниже).
4. На данной стации пытаются уточнить положения, приписываемые тяжелым
атомам, для чего используют либо методы разностного фурье-уточнения, до
некоторой степени подобные описанным в случае малых молекул, либо более
сложную технику.
5. Сравнивая данные о структурных факторах для исходного кристалла с
соответствующими данными для одного или нескольких тяжелоатомных
производных, можно оценить фазы каждого F(h, к, 1) для исходного
кристалла. В общем случае чем большим числом тяжелоатомных производных мы
располагаем, тем точнее будут оценки фаз.
6. Воспользовавшись данными о фазах для исходного кристалла, полученными
на предыдущем этапе, часто удается осуществить дальнейшее уточнение
положений тяжелых атомов, используя метод наименьших квадратов или
разностный фурье-синтез. Эта процедура в свою очередь приводит к еще
лучшим оценкам фаз для исходного кристалла.
7. Воспользовавшись этими фазами и наблюдаемыми амплитудами каждого F(h,
к, /), рассчитывают с помощью (13.93) карту электронной плотности.
8. Строят модель карты электронной плотности. Обычно на этой стадии
используются только данные низкого разрешения (5,5-7 А), и поэтому на
карте электронной плотности нет хорошо разрешенных структурных деталей.
Затем этапы 4-8 повторяют с данными более высокого разрешения (2,5 - 3
А), до тех пор пока не оказывается возможным построить молекулярную
модель.
9. Иногда пытаются уточнять полученную структуру. Например, с помощью
уравнения (13.70) можно рассчитать фазы, исходя из положений атомов в
молекулярной модели, а затем использовать эти фазы вместо тех, которые
определены на этапах 5 и 6. Уточнение может основываться на фурье-синтезе
или на методе наименьших квадратов; оно может опираться или только на
рентгеновские данные, или, помимо рентгеновских, и на данные об энергии
различных конформаций белка.
Большинство этих стадий обсуждается более детально ниже.
ПОЛУЧЕНИЕ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КРИСТАЛЛОВ И ИХ СВОЙСТВА
Для кристаллографического изучения молекулы с мол. массой 50 ООО нужны
кристаллы, имеющие размер около 0,3 мм в каждом измерении. Для получения
таких кристаллов необходимо, вообще говоря, приготовить пересыщенный
раствор макромолекул и контролировать скорость образования зародышей и
роста кристаллов. Растворимость можно менять, варьируя pH, концентрацию и
тип соли, температуру раствора, а также добавляя органические
растворители.
Одним из удобных способов контроля скорости изменения многих из этих
параметров является диализ. Другой способ основан на диффузии паров. При
этом способе капле раствора макромолекул дают возможность прийти в
равновесие (через парообразную фазу) с раствором, помещенным в отдельный
сосуд. Если, например, концентрация соли в таком сосуде выше, чем в
образце, то растворитель будет постепенно "уходить" из образца.
Дальнейшие детали этих и других методов приводятся в литературе
(см.Blundell T.L., Johnson L.N., 1976).
Кристаллы белков и нуклеиновых кислот отличаются от кристаллов малых
молекул в одном важном отношении: в них содержится значительное
