Биофизическая химия. Том 2 - Кантон Ч.
Скачать (прямая ссылка):
d{\n[e{t) - 0(со)]}/Л = - 1/т 1 (12.32)
Так как число Xj известно из предварительного механического рассмотрения,
то, определив тр ij0 и fa], с помощью уравнения (12.30) получаем величину
молекулярной массы. Такой подход не устраняет всех трудностей; очень
непросто, например, измерить характеристическую вязкость
высокомолекулярной ДНК. Другой подход использует эмпирически полученные
соотношения, связывающие [jj] с молекулярной массой. В случае ДНК
довольно хорошее согласие с экспериментом дает формула
М = А.([^] + Ь)зп (12.33)
где к = 19,8 для линейной формы ДНК, а Ъ = 500 см3/г. Пренебрегая
константой Ь в случае больших ДНК (характеристическая вязкость которых
может достигать 104 см3/г и более) и комбинируя уравнения (12.30) и
(12.33), получим (при 298 К)
М = 1,45 • 10873/5 (12.34)
Из формулы (12.34) вытекает несколько любопытных следствий. Молекулярная
масса пропорциональна степени 3/5 измеренной величины, что весьма
выгодно, поскольку ошибки измерений не слишком сильно влияют на
получаемый в итоге результат. Так как наблюдаемая в опыте величина
пропорциональна А/573, весовой коэффициент в формуле (12.31)
пропорционален ЛГ10/3. Допустим, что препарат гетерогенен: почти всегда
при выделении очень больших молекул ДНК в препарате оказывается некоторое
количество фрагментированной ДНК. Но процесс релаксации, описываемый
уравнением (12.31), определяется главным образом самой высокомолекулярной
фракцией; влияние остальных молекул крайне незначительно.
0(О-0(сс)сс?/(М?о/3ехр[ -f(2,2 • 108/М,)5/3] (12.35)
i
raefj - относительное число молекул с молекулярной массой Л/(. Таким
образом, даже половинки молекул не смогут внести заметный вклад в процесс
релаксации на заключительном этапе, а небольшие молекулы будут вовсе
"невидимы". Любые агрегаты, однако, могут сильно осложнить дело.
282
ГЛАВА 12
РИС. 12.7. Характеристическое время упруговязкой релаксации в зависимости
от молекулярной массы. Этот построенный в двойных логарифмических
координатах график показывает, как связана молекулярная масса ДНК,
выделенной из разных организмов, с наибольшим временем релаксаций т,
наблюдаемым при упруговязкой релаксации. Величины молекулярных масс ДНК
из Д. соИ, B.subtiUs и бактериофагов Т7 и Т2 были известны из других
источников. Эти значения были использованы при построении приведенной
здесь экспериментальной зависимости, с помощью которой смогли оценить
молекулярную массу целой ДНК, содержащейся в хромосоме дрозофилы.
[Kavenoff et al.. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 38. 1 (1974).]
На рис. 12.7 представлены типичные результаты измерений упруговязкой
релаксации ДНК. Обратите внимание на чрезвычайно большие времена
релаксации молекул, массы которых составляют - 109 и более а.е.м.
Отличное согласие с экспериментом, полученное для ДНК с известными
молекулярными массами, показывает, что формула (12.34) правильна. Данный
метод с успехом использовали для определения молекулярных масс ДНК вплоть
до значений, близких к 1011. Гигантские молекулы ДНК с такой молекулярной
массой (примером которых могут служить молекулы, выделенные из целых
развернутых хромосом бактерий или эукариот) настолько непрочны, что их
невозможно даже переместить из одного сосуда в другой. Для того чтобы их
исследовать, необходимо клетки, содержащие такую ДНК, подвергнуть лизису
непосредственно в ротационном вискозиметре и освободить ДНК in situ от
связанных с ней белков посредством обработки детергентами и
ферментативного расщепления. Для смешивания этих реагентов с клеточным
лизатом можно использовать только конвекцию, поскольку любое
перемешивание недопустимо. Естественно, приходится ограничиваться очень
малыми скоростями ротора, чтобы уменьшить вероятность разрыва молекулы в
градиенте скорости. Угол, на который повернется ротор за промежуток
времени между включением вращающего момента и началом процесса
релаксации, должен быть минимальным: это всегда менее одного оборота.
12.2. Методы, использующие вращательное движение молекул
Как было показано в гл. 10, для описания вращательного движения
несферических тел недостаточно просто коэффициента трения. Поэтому трение
приходится описывать с по-
ДРУГИЕ ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
283
мощью тензора f. Изучая вращательную диффузию, мы получаем распределение
W(6, ф, I) осей молекул по ориентациям точно так же, как при изучении
поступательной диффузии получаем распределение молекул в пространстве;
Щв, ф, t) здесь - доля молекул, угол ориентации которых лежит в пределах
от в до в + dd и от ф до ф + dф в момент времени I.
Соотношение, эквивалентное второму закону Фика. можно записать как
0W(0, ф, i),di = - L DBp • LU'(fl, ф, i) (12.36)
где L - оператор момента количества движения, a DBp - тензор вращательной
диффузии. Для многих предельных случаев, когда доминирует какая-нибудь
одна составляющая J6"p, уравнение (12.36) упрощается и принимает вид
ГМ'ЧКф.Ц ,п =ОИр\-И'(Н.0.м (,2'37)
Поскольку измерения вращательной диффузии проводят в отсутствие каких бы
