Водный обмен растений - Жолкепич В.Н.
ISBN 5-02-003977-2
Скачать (прямая ссылка):
Метод импульсного градиента магнитного поля. Наряду с измерением коэффициента самодиффузии методом постоянного градиента существует метод измерения D с импульсным градиентом магнитного поля. Этот метод отличается от предыдущего тем, что градиент магнитного поля создается не постоянно в течение всего эксперимента, а в виде двух идентичных прямоугольных импульсов, одного в интервале между 90°-ным и 180°-ным импульсами, другого — между 180° и моментом появ-
2*
35
ления эха [65]. Временная программа включения градиентных импульсов в двухимпульсной .программе Хана приведена на рис. 6.
Первый градиентный импульс как бы фиксирует начальные стартовые положения ядер, второй — контролирует, на какое расстояние ядра успели продвинуться за время между градиентными импульсами за счет своего теплового (броуновского) движения. Относительная амплитуда эха следует выражению [69]:
R — ехр — f2 82 g2 (к--8 ) Z),
где у — гиромагнитное отношение, б — длительность, g— амплитуда градиентных импульсов, А — временное расстояние между градиентными импульсами. Максимальная величина для этой программы в среднем равна 1,5—2 мс.
Импульсы градиента магнитного поля по амплитуде (g) могут быть велики, до 1000 гс-см-1 и выше, благодаря чему диапазон измеряемых значений D расширяется до 10-9 см2-с-1. Для маловязких жидкостей появляется возможность значительно сократить минимально необходимое для измерения D время наблюдения за диффундирующими молекулами, равное времени между градиентными импульсами (А). Так, для чистой воды измерение D легко осуществимо при времени наблюдения 2 мс в сравнении с 20 мс в методе постоянного градиента [65].
Практически для измерения D снимают зависимость относительной амплитуды эха R от g2 или А. В полулогарифмическом масштабе эти зависимости являются прямолинейными, наклон которых дает D.
Что дало применение метода ЯМР. Прежде всего был сделан вывод, не согласующийся с представлением об особой упорядоченности всей воды в клетках. Основой для этого было установление обратной зависимости коэффициента самодиффу-зии воды (D) в растворах белков и тканях растений от времени наблюдения, т. е. от длины пробега молекул. Такая зависимость может объясняться лишь влиянием «барьеров», ограничивающих диффузию воды (макромолекулы, мембраны, органеллы и др.). При сокращении времени наблюдения (т. е. при уменьшении среднего смещения молекул) количество барьеров на пути движения уменьшается, вследствие чего D увеличивается. Было высказано предположение, что при наиболее коротких
РИС. 6. Программа включения импульсов для измерения диффузии методом импульсного градиента магнитного поля
экспозициях, когда среднее смещение молекул становится меньше расстояния между барьерами, можно получить истинное значение коэффициента самодиффузии внутриклеточной воды. Другой причиной снижения D является гидратация макромолекул и низкомолекулярных веществ. Но значение ее меньше. Расчеты показали, что снижение D в 10%-ном растворе альбумина за счет барьеров составляет около 0,38-Ю-5 см2-с-1, а за счет гидратации — лишь 0,05¦ 10-5 см2*с-1.
Близость коэффициента самодиффузии (между барьерами) и энергии самодиффузии к соответствующим величинам для чистой воды послужила основой для представления (в дальнейшем, правда, уточненного), согласно которому большая часть воды клеток (до 85—90 %) по свойствам почти (или совсем) не отличается от чистой воды и лишь гидратная вода (10—15%) имеет измененные свойства (менее подвижна). По существующим представлениям, молекулы связанной и свободной воды обмениваются своими положениями.
Для чистой воды значения Т\ и Т2 равны и определяются интенсивностью броуновского (теплового) движения: чем быстрее это движение, тем длиннее времена релаксации. При комнатной температуре Ti^T2^ 3 с. Для молекул воды, адсорбированной на каких-либо поверхностях, например на макромолекулах белков, значения Т\ в сотни, а Т2 — в тысячи раз короче, чем в чистой воде, и сильно зависят от количества адсорбированной воды. Так, для воды, адсорбированной в количестве 10 % на альбумине, Г2 является величиной порядка 300 мкс. Для нормально оводнениых клеток Г2 воды имеет значения порядка 50—200 мс в зависимости от объекта [72, 73]. При этом укорочение времен релаксации, как правило, коррелирует с величиной отношения площади поверхности клеток к объему: чем
больше это отношение, т. е. чем больше площадь контакта молекул воды с неводными компонентами, тем короче времена релаксации. Это сопоставление времен релаксации показывает, что молекулы воды испытывают весьма заметное влияние со стороны неводных компонент и, следовательно, исходя из обратного, исследование характеристик воды может дать представление об изменениях в структуре и функциях клеток [65], о влиянии гидратации на состояние и функционирование белков реакционных центров путем сообщения им конформацион-ной подвижности.
Измерения времен релаксации молекул воды в биологических системах позволяют определить количество фракций воды, отличающихся релаксационными характеристиками, количество и подвижность молекул адсорбированной (связанной) воды, времена корреляции вращательного движения [74—76]. Если объект содержит протоны, отличающиеся резонансными частотами и обменивающиеся своими положениями, метод ЯМР позволяет определить скорость обмена, населенности (относительное количество) обменивающихся фракций, величину хими-
