Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
работах, посвященных разделению различных типов урокилазы [304] и
сывороточных липопротеинов [349], и ряде других исследовательских работ,
в которых изучалось разделение многих белков с использованием буферов,
содержащих додецилсульфат [327, 328, 332]. Во многих случаях для защиты
неподвижной фазы аналитических колонок от загрязнения рекомендуется
помещать между насосом и основной колонкой на линии высокого давления
небольшую предколонку.
J________I III___________I_____I - _I I I ' I I
I___________I______I_____I-----11-----1-----1-----------1-----1------1---
--1----LJ-I-
2 4 6 8 10 12 2 4 G 8 10
12 2 4 6 8 10 12 2 4 6
8 10 1.'
pH
Рис. 4.36. Влияние величины pH на константу распределения [359].
Неподвижная фаза: TSK 3000 SW; элюент: фосфатный или ацетатный буферные
растворы с ионной силой 0,001.
248 Глава 4
Рис. 4.37. Разделение лактат- и алкоголь-де-гидрогеназы методом аффинной
хроматографии [364].
Неподвижная фаза:
АМФ-силикагель; элюент: 0,1 М фосфат натрия (pH 7,5); температура:
комнатная.
4.3.6. Аффинная хроматография
ВЭЖХ-вариант биоаффинной хроматографии рассматривается лишь в считанном
числе работ. Первым в 1978 г. появилось сообщение о применении в качестве
неподвижной фазы глице-рилпропилсилилированного лихросорба Si 60 с порами
размером 60 А, модифицированного аминогексил-АМФ или антителами к
человеческому сывороточному альбумину [364]. На АМФ-колонке разделяли
смесь алкоголь-дегидрогеназы, лактат-де-гидрогеназы и сывороточного
альбумина путем биоспецифиче-ского элюирования или элюирования раствором
с высокой концентрацией соли. Пример такого разделения показан на рис.
4.37.
На колонке с иммобилизированными антителами к человеческому
сывороточному альбумину разделяли бычий и человеческий сывороточные
альбумины при снижении pH элюента. В работе [365] описано применение двух
других иммобилизованных антител. Иммобилизация антител проводилась под
воздействием аналогичной неподвижной фазы глицерилпропил-силилированного
лихросфера Si 1000 с порами размером 1000 А. Колонка с антителами к
человеческому иммуноглобулину G использовалась для изучения
взаимодействия антиген - антитело. Десорбция достигалась путем снижения
pH элюента. Колонку с иммобилизованными моноклональными антителами на
инсулин элюировали разбавлением ацетонитрилом. Во всех
Аминокислоты, пептиды, белки 249
этих экспериментах наблюдалось практически количественное специфическое
связывание и только незначительное неспецифическое взаимодействие [364,
365].
4.4. Заключение
Итак, методы ВЭЖХ широко используются в химии белков, пептидов и
аминокислот в целях выделения и очистки этих соединений и для определения
их биохимических характеристик. Многие методы ВЭЖХ можно рассматривать
как существенно улучшенные варианты классических методов. Однако целый
ряд методов представляет собой оригинальные разработки в области ВЭЖХ.
Все указанные методы отличаются высокой чувствительностью, самой пока
высокой разрешающей способностью и позволяют проводить разделение с
высокой скоростью.
Литература
1. Sober Н. A. (ed.), in: Handbook of Biochemistry, B3. The Chemical
Rubber Co. 1970.
2. Wold F. Ann. Rev. Biochem., 50, 783 (1981).
3. Spackmati D. H., Moore S., Stein W. H. Anal. Chem., 30, 1190 (1958).
4. Molnar Horvath C. J. Chromatogr., 142, 623 (1977).
5. Radjai М. K., Hatch R. T. J. Chromatogr., 196, 319 (1980).
6. Schuster R. Anal. Chem., 52, 617 (1980).
7. Foucault A., Gaude М., Oliveros L., J. Chromatogr., 185, 345 (1979).
8. Roth M. Anal. Chem., 43, 880 (1971).
9. Ishida Y., Fujtta Т., Asai K. J. Chromatogr., 204, 143 (1981).
10. Drescher D. G., Lee K. S. Anal. Biochem., 84, 559 (1978).
11. Tikkhomirov М. M" Khorlin A. Y., Voetter W., Bauer H. J.
Chromatogr.,
167, 197 (1978).
12. Drescher M. J., Medina J. E" Drescher D. G. Anal. Biochem,, 116, 280
(1981).
13. Hughes G. I., Winterhalter К. H., Boiler ?., Wilson K. J. J.
Chromatogr.,
235, 417 (1982).
14. Kraak J. C., Jonker К. М., Huber I. F. K. J. Chromatogr., 142, 671
(1977).
15. Swarup G., Cohen S.. Garbers D. L. J. Biol. Chem., 256, 8197 (1981).
16. Yang J. C., Fujitaki J. М., Smith R. A. Anal. Biochem., 122, 360
(1982).
17. Sanger F. Biochem. J., 39, 507 (1945).
18. Zimmerman C. L., Pisano J. J., in: С. H. W. Hirs, Timasheff S. N.
(eds.): Methods in Enzymology, XLV1I, p. 45, Academic Press, New York-San
Francisco-London, 1977.
19. Gray W. R., in: С. H. W. Hirs and S. W. Timasheff (eds.): Methods in
Enzymology, XXV, p. 121, 333, Academic Press, 1972.
20. Bayer E., Grom E" Kaltenegger B., Uhmann R. Anal. Chem., 48, 1106
(1976).
21. Wilkinson J. M. J. Chromatogr. Sci., 16, 547 (1978).
22. Tapuhi Y" Miller N., Karger B. L. J. Chromatogr., 205. 325 (1981).
23. De Jong C., Hughes G. J., van Wieringen E., Wilson K. J. J.
