Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
фрагменты белка вируса, полученные обработкой бромцианом, в н г -
трипсиновый гидролнзат альдегид-дегндро-теназы.
Аминокислоты, пептиды, белки 245
о хороших выходах биологически активных белков [352, 355].
Основу большой группы неподвижных фаз составляет гли-
церилпропилсилилированное пористое стекло или силикагель. Если для
получения таких фаз используется стекло с контролируемой пористостью,
полученный продукт называется гликофаза G [271, 361], а если в основу его
положен силикагель с мелкими частицами неправильной формы-лихросорб, то
полученный продукт называется лихросорб диол [362, 363]. Если же основу
неподвижной фазы составляет сферический силикагель лихросфер или видак TP
Si, продукт называется синхропак GPS [263, 266, 271, 277, 356, 259, 260].
Многие из таких носителей поступают в продажу. Размеры пор у таких
носителей могут быть самыми различными, но наибольшее распространение
получили носители с порами диаметром 100 А. Как и для других носителей на
основе стекла или силикагеля, рекомендованный диапазон значений pH
ограничен от 2 до 8.
Гликофазы G были использованы для изучения связывания сывороточного
альбумина с лекарственными средствами [361]. Авторы работ [362, 363]
получили кривую зависимости объема элюирования от молекулярной массы
белков для колонок с лихросорбом диолом, которая оказалась линейной в
диапазоне 10 000-100 000.
В нескольких статьях описано хроматографическое разделение на колонках
с синхропаком GPS-100 с порами размером 100 А. Авторы ряда статей
сообщают о линейности градуировочных кривых для определения молекулярных
масс белков в диапазоне от 5000 до 500 000, полученных при использовании
обычных буферов [266, 356], и от 1000 до 70 000 для буферов, содержащих 1
% додецилсульфата натрия [263]. Сообщается также о хороших выходах белков
с сохранением биологической активности [404]. Добавление к буферу 1 %
додецилсульфата натрия и 30% метанола значительно улучшает выход белков
[263]. Изучены также аналогичные носители на основе силикагеля с порами
размером 300 и 500 А [266, 360]. В большинстве своих работ Шварц и др.
[360] использовали в качестве элюента 50%-ную муравьиную кислоту, и
никакого отрицательного влияния на носитель это не оказывало.
Следует отметить некоторые общие свойства гель-проникаю-щей
хроматографии. Размер колонки, как это со всей очевидностью установлено,
влияет на разрешение и на емкость, Длина поступающих в продажу колонок
составляет от 25 до 60 см. Однако в печати сообщается и об использовании
колонок длиной от 120 до 180 см, причем даже в аналитических целях.
Диаметр колонки не должен быть слишком маленьким, более широкие колонки
дают лучшее разрешение [266]. Увеличение как массы, так и объема пробы
отрицательно сказывается на разрешении [266, 277, 362]. На колонку
диаметром 7,5 мм
246 Глава 4
можно наносить пробу в несколько миллиграмм белка. Для получения
оптимальных результатов объем пробы должен быть меньше 100 мкл. Следует
учитывать растворимость белка и вязкость раствора пробы. Высокая вязкость
вызывает размывание полос.
Тщательное изучение влияния скорости элюента на разрешение [266, 313]
показало, что для получения оптимального разрешения объемная скорость
должна быть очень низкой: так, для колонки диаметром 7,5 мм она должна
составлять от 10 до 50 мкл/мин. Однако в большинстве публикаций
сообщается об использовании значительно более высоких объемных скоростей-
от 0,5 до 1 мл/мин. В то же время объемная скорость не влияет на объем
удерживания, поэтому следует искать разумное компромиссное соотношение
между разрешением и временем, затрачиваемым на проведение анализа.
Качество разделения в очень большой степени зависит от состава
растворителя, так как он влияет на взаимодействие между белком и
неподвижной фазой [404]. Этот эффект был специально изучен для
неподвижных фаз на основе силикагеля. Остаточные свободные силанольные
группы выступают в роли остатков слабой кислоты с рК от 3,5 до 4,0 [359].
В результате влияние заряда проявляется в виде ионной эксклюзии при
значениях pH растворителя выше изоэлектрической точки белка и ионной
сорбции при значениях pH ниже изоэлектрической точки белка, но выше рК
силанольных групп. При минимизации взаимодействий белка и неподвижной
фазы, т. е. при проведении разделения в области значений pH, близких к
изоэлектрической точке белка, мы только приближаемся к идеальному
процессу гель-прони-кающей хроматографии [359]. Эти эффекты показаны на
рис. 4.36.
Наиболее сильное взаимодействие возникает при низкой ионной силе
элюента, в то время как более высокие концентрации соли экранируют заряды
[301, 359, 363]. Отклонения от идеальности при проведении гель-
проникающей хроматографии могут в ряде случаев при решении некоторых
проблем разделения обернуться преимуществами, как это показано в работе
[359]. Необходимость подбора оптимального типа соли для приготовления
буфера, концентрации и значения pH буфера была продемонстрирована в
