Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
разделить более 70 компонентов, что, однако, значительно меньше
описанного для системы двумерного геля О'Фаррелла [236].
Следует упомянуть еще несколько примеров применения ВЭЖХ на
неподвижных фазах типа TSK SW. Этим методом удалось разделить ряд очень
сложных смесей - белки сыворотки крови [302, 306, 309, 314, 336, 338],
мочи [317]. и молока [306, 307].
Ферменты [3-галактозидаза и уреаза были выделены из грубых экстрактов
на неподвижной фазе TSK 3000 SW с выходом по ферментативной активности,
близким к количественному [303]. Ряд изоферментов урокиназы с различными
молекулярными массами можно количественно охарактеризовать посредством
анализа на TSK 3000 SW. Выход по ферментативной активности в этом случае
составляет 95-100% [304, 339]. Про-теолитическая активация протромбина
изучалась хроматографически на TSK 3000 SW; время удерживания
кальцийсвязыва-ющих ферментов было больше в присутствии ионов кальция
[414]. Образование комплекса ингибитором протеиназ из сыворотки крови и
различными сериновыми протеиназами можно изучать методом хроматографии на
TSK 2000 и 3000 SW [340].
Гетерогенность липопротеинов сыворотки крови можно установить путем их
разделения на TSK 3000 и 4000 SW после специфического окрашивания
липопротеинов диформазановыми красителями [319] или путем избирательного
обнаружения холима. и холестерина в элюате [318].
Металлопротеины были идентифицированы в экстрактах печени, почек и
селезенки с использованием разделения на неподвижной фазе TSK 3000 SW и
специфических методов обнаружения [311, 342].
Мембранные белки из Halobacterium были очищены на колонках с TSK 3000
и 4000 SW элюированием буферным раствором, содержащим 0,1%
додецилсульфата натрия [330, 331]. Мембранный белок цитохром Ь-561 был
проанализирован в присутствии 0,1%-ного неиогенного детергента тритона Х-
100 на
Аминокислоты, пептиды, белки 243
колонке с TSK 3000 SW с целью оценки степени его чистоты и вероятности
образования связей детергент-белок [344].
Неподвижные фазы типа TSK SW наиболее удобны для разделения крупных
фрагментов пептидов. Изучение разделения фрагментов бромцианового
расщепления белка капсида вируса и триптических фрагментов альдегид-
дегидрогеназы методом хроматографии на колонке с TSK 2000 SW показало,
что этот метод хроматографии отличается более высокой разрешающей
способностью, чувствительностью и быстротой проведения анализа по
сравнению с классической хроматографией на мягких гелях. Полученная
хроматограмма представлена на рис. 4.35. Определенный недостаток ВЭЖХ-
варианта гель-проникающей хроматографии - низкая емкость колонок по
белку. Если этим методом проводят обессоливание проб белка, то на колонку
можно наносить только небольшие объемы.
Второй тип носителя TSK, имеющий индекс PW, представляет собой
полужесткий гидрофильный полимер, устойчивый к действию растворителей в
диапазоне pH от 2 до 12. В продаже имеется несколько его видов,
различающихся размером пор (табл. 4.6). Хотя он не рекомендован как
наиболее пригодный для разделения белков, в ряде работ [346-348]
опубликованы градуировочные кривые зависимости объема элюирования белков
от их молекулярной массы. Колонки с TSK PW были использованы и отдельно,
и в сочетании с колонками TSK SW для разделения и анализа липопротеинов
сыворотки крови [348-350].
Третий, новейший тип носителя для гель-проникающей хроматографии фирмы
Toyo Soda Corporation получил название гойоперл HW, или фрактогель HW.
Этот полужесткий гидрофильный полимер, поры которого могут иметь
различные размеры, устойчив в очень широком диапазоне значений pH. Размер
его частиц больше, чем у типов SW и PW, и составляет от 25 до 40 мкм или
больше. Для тойоперла HW 55 - носителя, на котором можно проводить
фракционирование белков с относительной молекулярной массой от 10 000 до
1 000 000, опубликована градуировочная кривая и данные по выходу по
ферментативной активности, который был очень высоким [351]. Однако о его
применении пока известно очень мало.
Колонки с Waters 1-125 используются в тех же целях, что и колонки с
TSK SW [352]. Для этого материала также получены градуировочные кривые
для определения молекулярной массы в диапазоне от 2000 до 20 000 [320,
353]. Поскольку основу его составляет силикагель, он может работать в
диапазоне значений pH от 2 до 8. Автор работы [354] рекомендовал
добавлять в буферный раствор при определении молекулярной массы белков до
20% этанола. При очистке гидрофобного цитохрома с добавляют 1%
дезоксихолата [354]. Опубликованы данные
16*
S4
I
Обьем.мл
Объем,мл
20
Время.ч
40
ih
Объем,мл
Время,ч
Рис. 4.35. Сравнение ВЭЖХ и классической гель-проникающей хроматографии
[305, 345].
Неподвижная фаза (колонка): а и в - сефадекс G-50 мелкий (2000X15 мм), б
-TSK 2000 SW (500X7.5 мм), г -TSK 2000 SW (600X7,5 мм); элюент: а и в -
30%-ная уксусная кислота, 6 и г -0,1 М бикарбонат аммония; проба: а и б -
