Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 71

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 65 66 67 68 69 70 < 71 > 72 73 74 75 76 77 .. 296 >> Следующая

Используя смолы с малым размером частиц (5 мкм) и чувствительные
флуориметрические методы обнаружения, можно проводить идентификацию и
количественный анализ аминокислот на субпикомольном уровне.
Тихомиров и др. [11] описали метод одновременного обнаружения
аминокислот, аминосахаров и нейтральных сахаров (рис. 4.5). Для
обнаружения аминокислот эти авторы использовали нингидрин, а для
обнаружения сахаров - смесь орсин/ /серная кислота.
Дрешер и Ли [10] опубликовали метод аминокислотного .анализа белков,
элюированных из полиакриламидного геля. После экстракции окрашенной
полосы белка из геля с помощью додецилсульфата натрия и последующего
гидролиза под действием метансульфокислоты они проводили анализ
полученной смеси аминокислот на катионообменной колонке. Для обнаружения
применялась послеколоночная модификация фталевым альдегидом, часть
элюата, содержащая пролин, предварительно обрабатывалась хлорамином Т для
окисления пролина. Полученная этим методом хроматограмма приведена на
рис. 4.6.
Позднее Дрешер и др. [12] описали систему ВЭЖХ для анализа большего
числа аминокислот и родственных им соединений, содержащихся в
биологических жидкостях. Разделение эти авторы выполняли на
катионообменной смоле (с частицами размером 5 мкм), элюируя пробу
буферными растворами цитрата лития в градиентном температурном режиме.
Обнаружение осуществлялось флуор и метрически после реакции с фталевым
альдегидом. Предел обнаружения описанным методом равен примерно 0,5
пмоль, длительность анализа 5 ч. Хроматограмма, полученная этим методом,
представлена на рис. 4.7.
В 1982 г. авторы работы [13] сообщили о разделении смеси аминокислот,
обычно присутствующих в белковых гидролизатах, которое они провели за 45
мин на стандартном оборудовании для ВЭЖХ, обычно применяемом для
разделения пептидов и белков. Неподвижной фазой служила катионообменная
смола, элюентом - формиатный буферный раствор. Нижний предел обнаружения
составлял несколько наномолей, если реагентом служил нингидрин, и
несколько пикомолей, если реагентом был фталевый альдегид.
Авторы работы [14] использовали для разделения аминокислот
генерируемую растворителем (динамическую) ионообменную систему, состоящую
из гидрофобной неподвижной фазы (обращенная фаза С8) и элюента,
представляющего собой смесь вода/органический растворитель с небольшой
добавкой
t.MMH
Рис. 4.6. Разделение аминокислот (300 пмоль) [10].
Неподвижная фаза: катионообменник аминко J5-7409; элюент: буферные
растворы формиата и бората натрня (pH 3,25-10,8), элюирование в
градиентном режиме; температура: 51 °С.
СБ-пик, появление которого обусловлено сменой буферного раствора.
t,MHH
Рис. 4.7. Разделение аминокислот н родственных им соединений метолом
ионообменной хроматографии \Щ.
Неподвижная фаза: аминко J5-7409; элюеит: буферные растворы цитрата
лития (pH 3,2- 7,7): температура: 37-62 °С.
/- фосфо-Ser: 2 - таурин: 3 - фосфоэтаноламни; 4 - Asp: 5- Thr; 6 - Ser;
7 -Gin: 8- Asn; 9 -Gin; 10- а-амииокислота: 11-Gly; 12 - Ala; 13 -
цитрулин; 14 - Abu;
15 - cys; 16 - Val; 17 - Met; /8 - ?; 19 - lie; 20 - Leu; 21 - Nle; 22 -
Tyr: 23 - Phe: 24 - гомоцнстии; 25 - 0-Ala; 26 - fl-Alb; 27 - v-Aib; 28 -
Trp; 29 - His; 30 - His (3-Me); 31 - His (I-Me); 32 - карнознн; 33 - Hyl;
34 - ансерин; 35 - этаноламин; 36 - аммиак; 37 - Orn; 38 - Lys; 39 - а-
амнно-Р-гуаиидиипропноновая кислота; 40 - Arg; СБ1, СБ2, СБЗ - пики,
появление которых обусловлено сменой буферного раствора.
Аминокислоты, пептиды, белки 1ч3
t.MHH
Рис. 4.8. Разделение фосфогидроксиамино-кислот методом ионообменной
хроматографии [16].
Неподвижная фаза: партисил 10 SAX; элюеит:
10 мМ буферный раствор фосфата калия (pH 3)/12,5%*иый метаиол (по
объему).
анионного детергента. Гидрофобные части молекул детергента связываются в
результате гидрофобного взаимодействия с обращенной фазой, а свободные
заряженные гидрофильные группы выполняют ионообменные функции.
Обнаружение осуществлялось после проведения реакции с нингидрином. В
указанной работе подробно обсуждается влияние ряда хроматографических
параметров. Создается впечатление, что такие системы с генерируемыми
растворителем ионообменными свойствами обладают лучшей селективностью,
чем традиционные ионообменные системы.
Методом ВЭЖХ можно также анализировать фосфогидрок-сиаминокислоты
(фосфосерин, фосфотреонин, фосфотирозин). В литературе описаны два метода
разделения соединений этого класса. Сваруп и др. [15] разделяли
фосфогидроксиамино-кислоты на анионообменной неподвижной фазе ультрасил
АХ, используя в качестве элюента фосфатный буфер (pH 7,8). Обнаружение
проводилось по поглощению при 206 нм. В более поздней работе Янга и др.
[16] описан метод разделения с полным разрешением пиков (до нулевой
линии) смеси фосфо-гидроксиаминокислот на анионообменной смоле партисил в
результате элюирования смесью фосфатный буфер (pH 3,0)/метанол.
Обнаружение проводилось флуориметрически после обработки элюата фталевым
Предыдущая << 1 .. 65 66 67 68 69 70 < 71 > 72 73 74 75 76 77 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed