Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 54

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 48 49 50 51 52 53 < 54 > 55 56 57 58 59 60 .. 296 >> Следующая

оно заслуживает. Поэтому нам хотелось бы подчеркнуть достоинства этого
метода.
З.6.4.1. Некоторые общие рекомендации по применению. Количество
флуоресцентного света, излучаемого возбужденными молекулами в
разбавленном растворе, пропорционально а) интенсивности источника
возбуждающего излучения; б) объему освещаемого раствора пробы (в данном
случае длина оптического пути должна быть минимальной, что требует
абсолютно иной геометрии ячейки, чем в абсорбционном детекторе); в)
квантовой эффективности флуоресценции пробы (отношение излучающего и
неизлучающего энергетических переходов из возбужденного состояния в
нормальное может быть оптимизировано путем подбора соответствующих
условий возбуждения); г) концентрации раствора обнаруживаемого
соединения.
Флуоресцентное (и фосфоресцентное) излучение испускается из
(облучаемого) образца во всех направлениях. В идеальном случае это
излучение следовало бы собирать сферическим зеркалом, помещенным вокруг
ячейки с образцом. Однако это зеркало не должно собирать свет,
поступающий непосредственно от источника возбуждающего излучения.
Перечислим некоторые факторы, способные искажать результаты измерения
флуоресценции.
Растворенный кислород (см. также разд. 3.2.1) или другие содержащиеся
в элюенте примеси, способные вызывать гашение флуоресценции.
Рассеянный свет (от источника возбуждающего излучения), возникающий
вследствие наличия в элюате крупных молекул других рассеивающих излучение
частиц или вследствие наличия красителей и т. д. на поверхности рабочей
ячейки детектора или в других участках оптической схемы; светорассеяние
можно заметить по увеличению уровня шумов и сокращению диапазона
линейности выходных характеристик детектора.
Существует несколько способов увеличения квантового выхода
флуоре'сценции и фосфоресценции.
Длину волны возбуждающего излучения следует выбрать таким образом,
чтобы образовывалось максимальное количество молекул в возбужденном
состоянии (триплетном), а возврат в нормальное состояние происходил в
основном в результате излучения.
Использование мицеллярных растворов для индуцирования фосфоресценции
(при комнатной температуре) [32].
Добавление в элюат соединений (например, диацетила), молекулы которых
способны переходить в триплетное состояние в результате (неизлучающего)
переноса энергии от возбужденных молекул образца; в дальнейшем измеряется
фосфоресцент-
Аппаратура 137
пое излучение, возникающее в результате спонтанного перехода молекул
"акцептора" в основное состояние [35].
3.6.4.2. Источники возбуждающего излучения. В принципе
в флуориметрических детекторах можно использовать любой источник света с
фильтром (или монохроматором), пригодный для абсорбционной фотометрии.
Фокусирующая оптика, однако, должна удовлетворять требованиям,
предъявляемым геометрией ячейки флуориметрического детектора. Это
означает, что освещение данного объема образца (ограниченного по
соображениям минимального размывания полосы вещества) должно проводиться
по наиболее короткому световому пути, В тех случаях, когда необходимо
предельно понизить нижний предел обнаружения, следует применять фильтр,
дающий максимально возможное светопропускание на выбранной длине волны
возбуждающего излучения (а не с самой узкой полосой пропускания), и
максимально снизить интенсивность излучения с большей длиной волны,
особенно в области полосы пропускания эмиссионного фильтра. Источники
излучения высокой интенсивности типа ксеноновых ламп создают хорошие
условия для измерения флуоресценции при условии отсутствия шумов, причины
возникновения которых описаны в разд. 3.6.3.2. В литературе обсуждается
возможность использования в качестве источников возбуждающего излучения
для флуориметрического обнаружения лазеров [34] и 63№-ламп [35].
3.6.4.3. Измерение испускаемого излучения. В идеальном случае
флуоресцентное излучение, возникающее в результате соответствующего
возбуждения молекул пробы, измеряется относительно темного фона. Таким
образом, основной источник шумов детектора - это шум, возникающий в
результате темпового тока фотоприемника, который в основном зависит от
температуры. Как правило, увеличение температуры фотодиода на 10 °С
удваивает шумы, возникающие вследствие темно-вого тока.
Шум (пропорциональный корню квадратному из значения интенсивности
излучения), являющийся основной помехой при абсорбционном обнаружении при
флуориметрическом обнаружении, можно не принимать во внимание. Таким
образом, нижний предел обнаружения соединений, имеющих высокую квантовую
эффективность флуоресценции, при флуориметрическом обнаружении может быть
на порядок лучше, чем при абсорбционном.
В флуоресцентной спектроскопии находят применение детекторы на основе
линейных гребенок фотодиодов (см. также разд. 3.6.3.2) и
полупроводниковых .фотоумножителей, которые в будущем найдут применение и
в ЖХ [36-38].
133 Глава 3
3.6.5. Электрохимические детекторы
Предыдущая << 1 .. 48 49 50 51 52 53 < 54 > 55 56 57 58 59 60 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed