Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
обогащение колонки примесями, содержащимися в растворителе. Эти примеси
элюируются из колонки (вместе с компонентами пробы) при увеличении
элюирующей способности растворителя. Вода, очищенная перегонкой или
обратным осмосом, лучше, чем деионизованная. В тех случаях, когда работа
ведется с высокочувствительными детекторами, рекомендуется дополнительная
очистка на обращенно-фазовой колонке (большого объема) [29].
Высокое "фоновое" поглощение (т. е. поглощение на длине волны
обнаружения, обусловленное подвижной фазой) допол-
Аппаратура I3i
Измерительная ячейка
Рис. 3.20. Оптическая схема УФ-детектора с фиксированной длиной волны (с
разрешения Hewlett-Packard GmbH, Waldbronn, FRG).
нительно увеличивает шумы нулевой линии, что приводит к уменьшению
рабочего диапазона линейности детектора. Несмотря на то что электроника
детектора может быть способна "сбалансировать" сигнал до кажущегося
нулевого поглощения, детектор по-прежнему "видит" суммарное (т. е. общее)
поглощение подвижной фазы и растворенного вещества. Некоторые детекторы
способны предупреждать оператора о наличии высокого фонового поглощения.
3.6.3.2. Типы абсорбционных детекторов. Основные компоненты
абсорбционного детектора следующие: источник света,
фокусирующая оптика, оптический фильтр, одна или две проточные кюветы,
оптика фокусирования прошедшего луча, фотодетектор (ы) и электронная
схема обработки сигнала. Детекторы можно квалифицировать по конкретным
характеристикам этих элементов и их оптической организации.
В детекторах с фиксированной длиной волны используются так называемые
линейчатые источники света, т. е. лампы, которые излучают на нескольких
дискретных длинах волн (линиях). К наиболее распространенным лампам этого
типа относится ртутная лампа низкого давления, излучающая более 90% света
с длиной волны 254 нм (другие линии излучения: 313, 365, 405, 436, 546 и
579 нм). Длины волн меньше 254 нм дают цинковая лампа (214 нм) и
кадмиевая лампа (229 и 326 нм). Сочетание лампы и фильтра (вырезающего
или отсекающего) определяет фиксированную рабочую длину волны детектора.
Большинство типов детекторов позволяют проводить замену фильтра и
источника света. Типичная оптическая схема такого детектора показана на
рис. 3.20.
К преимуществам детектора с фиксированной длиной волны относятся
низкий уровень шума вследствие высокой интенсивности света (на главной
полосе излучения лампы), низкая
9*
132 Глава 3
стоимость инструмента и работы с ним, надежность и простота в обращении.
Детектор с ртутной лампой на 254 нм может практически считаться "рабочей
лошадкой" рутинной ВЭЖХ. Типичный уровень шума такого детектора
составляет 1-10_5ед. поглощения, средняя стоимость замены лампы от 100 до
200 долл. США, среднее время работы лампы 5000 ч.
В детекторах с переменной длиной волны (ПД) используются источник
света с непрерывным спектром излучения и настраиваемый узкополосный
фильтр, который называется монохроматором. Наиболее часто используемым в
этих целях источником света является дейтериевая лампа, диапазон
излучения которой лежит в интервале от 190 до 600 нм и максимум
интенсивности - в интервале от 220 до 240 нм. Выше 300 нм интенсивность
излучения невысока, поэтому для получения хорошей чувствительности
детектора необходимы фильтры с относительно широкой полосой пропускания.
Типичное время работы лампы D2 составляет всего от 500 до 800 ч. Имеющая
более высокую интенсивность излучаемого света ксеноновая Лампа не нашла
широкого применения.
Некоторые детекторы этого типа имеют дополнительную, или
вспомогательную, вольфрамовую лампу, с которой можно работать при длинах
волн выше 350 нм.
Традиционные детекторы с переменной длиной волны представляют собой
спектрофотометры (поглощающие в УФ- или видимой области) общего
назначения с ручной микрометрической настройкой монохроматора. При работе
с детекторами этого типа выбирается такая длина волны, на которой
поглощают все интересующие компоненты пробы; изменение установки длины
волны в процессе элюирования пробы вряд ли возможно (в нормальных
условиях количественного анализа).
В последние годы были разработаны новые модели таких детекторов,
предназначенные специально для ВЭЖХ, которые позволяют проводить быструю
автоматическую смену длины волны за 1-2 с или менее во всем рабочем
диапазоне длин волн, обычно от 190 до 600 нм. Примеры оптических схем
двух таких детекторов с быстрой автоматической сменой длин волн показаны
на рис. 3.21 и 3.22. Детекторы этого типа позволяют' оператору
программировать во времени ряд смен длины волны, осуществляемых в
процессе хроматографического анализа (преимущественно в интервалах между
элюированием отдельных компонентов). Это означает, что установку длины
волны можно индивидуально оптимизировать с целью увеличения селективности
обнаружения или снижения предела обнаружения (или и для того, и для
другого) для нескольких или всех интересующих компонентов пробы. В идеале
