Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
отклоняющего типа. Если КП элю-ентов существенно различаются, может
потребоваться смена призм детектора, что значительно ограничивает его
гибкость в работе.
3. Измерение КП методом интерференции света (рис. 3.19): длина
оптического пути световой щели б является функцией геометрических
размеров щели I и коэффициента преломления оптической среды ns Ь = 1п8,
т. е. изменение КП вызовет изменение длины оптического пути. Это явление
используется в рефрактометрическом детекторе, схематически изображенном
Аппаратура 129
на рис. 3.19. Один из двух когерентных пучков света проходит через
рабочую ячейку, другой - через ячейку сравнения, затем оба пучка
накладываются друг на друга и интенсивность света измеряется фотодиодом.
Если КП в рабочей ячейке и ячейке сравнения одинаковы, то различия в
фазах интерферирующих пучков не наблюдается, и интенсивность света,
поступающего на светодиод, максимальна. Если КП образца и жидкости в
ячейке сравнения отличаются на Ап, возникает разность фаз двух
интерферирующих пучков света: А6 = 1Ап, что приводит к уменьшению
интенсивности света с минимумом при Л6 = 0,5Л (Я - длина волны
интерферирующего света). Например, при /=1 см и Я=600 нм изменения
интенсивности света от максимума до минимума вызываются изменением ris от
0 до 3-10""5 Д ед. КП. Этот тип рефрактометрического детектора имеет в
настоящее время лучший НПО при уровне шумов до 1 • 10~9 А ед. КП. Однако
его рабочий диапазон линейности ограничен, так как, если Л6 превысит
0,5X, интенсивность света вновь начнет возрастать до тех пор, пока Д6=Л и
т. д., что делает выходной сигнал неоднозначным.
3.6.3. Абсорбционные детекторы, работающие в УФ-
и видимой областях
3.6.3.1. Руководство к применению. В основу количественной абсорбционной
фотометрии положен закон Ламберта - Бэра: абсорбция А (логарифм отношения
интенсивности падающего света и света, прошедшего через поглощающую
среду) раствора пропорциональна концентрации cs поглощающего вещества,
длине оптического пути I и коэффициенту е.
А = ecsl
Применение этого закона связано с соблюдением некоторых ограничений.
а. В пределах ошибки измерения е можно считать постоянной до = 0,1
моль/л.
б. "Кажущиеся отклонения" от закона возникают в том случае, если
свет, используемый для измерения поглощения, не является
монохроматическим (слишком широкая полоса пропускания через монохроматор
или слишком много рассеянного света), и спектр поглощающего вещества
показывает большое изменение е в зависимости от К при номинальной длине
волны проводимых измерений или вблизи этой волны. В ЖХ ширина полосы
пропускания обычно составляет от 2 до
4 нм (или меньше), что позволяет достичь приемлемой линейности (т. е.
^1%) в диапазоне до 0,5 (до 1) ед. поглощения. Если для увеличения
чувствительности (светового выхода) необходима большая полоса
пропускания, следует проверить, со-
9- 14 П
130 Глава 3
храняется ли при этом линейность по крайней мере для тех компонентов
проб, которые дают большие сигналы.
в. "Истинные отклонения" от закона, т. е. изменения значения е
раствора, которые могут быть вызваны смещением химического равновесия или
межмолекулярными силами. Это касается, например, процессов диссоциации и
ассоциации, а также степени сольватации. В ЖХ данный эффект возникает в
основном в водных растворах, не обладающих буферной емкостью, и (или) при
высокой концентрации пробы. Если элюирование ведется подобными подвижными
фазами, все процедуры градуировки и анализа пробы должны выполняться при
одинаковых значениях pH и ионной силы подвижной фазы и с одинаковыми
градиентами состава подвижной фазы, если таковые применяются.
Другие вторичные эффекты, способные повлиять на точность
количественных результатов анализа при работе в области НПО, в основном
связаны с условиями прохождения подвижной фазы через ячейку детектора.
Поскольку растворитель подвижной фазы в ячейке - это часть оптической
системы детектора, изменения его коэффициента преломления (КП) могут
влиять на условия прохождения света и тем самым "имитировать" изменения
поглощения и вызывать блуждание нулевой линии и ошибки в определении
количественных характеристик пиков. Изменения КП подвижной фазы возникают
при градиентном элюировании и в результате флуктуаций температуры, а
изменения объемной скорости приводят к возмущениям нулевой линии.
Возникают как бы локальные завихрения, частота и распределение которых в
ячейке зависят от объемной скорости подвижной фазы. Этн возмущения
создают "слоистость" (нерегулярные слои с различным КП), которая
воспринимается детектором как поглощение. У хороших детекторов такого
типа зависимость от объемной скорости меньше 1 • 10~3 ед.
поглощения/мл/мин. О влиянии воздуха (кислорода), растворенного в
подвижной фазе, говорилось в разд. 3.2.1.
Следует отметить, что при градиентном элюировании с использованием
подвижной фазы с низкой элюирующей способностью может наблюдаться
