Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
детектора составляет порядка 1 ¦ 10~8 А ед. КП.
Как правило, при использовании неспецифических (универсальных) методов
обнаружения, в том числе и рефрактометрического, теоретическое значение
НПО детектора может искажаться рядом побочных эффектов. Температурная
зависимость КП растворителей лежит в пределах от 2 до 4-10~4 А ед.КП/°С.
Влияние давления составляет около 5-10_5Аед. КП/бар [28]. КП жидкости,
насыщенной газом (например, воздухом), отличается примерно на 10-4-
10~5Аед. КП от значений, полученных для полностью обезгаженных
растворителей. Таким образом, работая с системами жидкостной хроматограф
- рефрактометрический детектор в областях обнаружения, близких к НПО,
следует принимать определенные меры предосторожности. Флуктуации потока с
малым периодом (шумы, пульсации или блуждания потока) должны быть меньше
0,01 мл/мин на
126 Глава 3
Измерительная ячейка
ФОТОДИОДЫ
1 ns<nR
J п$=пц (параллельное | прохождение) Jns>nR
Рис. 3.16. Схема действия рефрактометра, работающего по принципу
измерения отклонения луча.
выходе из колонки, не следует также устанавливать на выходе из детектора
какие-либо ограничители потока. Колонка должна работать в условиях
термостатирования. Капиллярные соединения между колонкой и детектором и
сам детектор должны быть защищены от сквозняков и прямого нагрева. Ячейку
сравнения детектора (при работе в "статическом" режиме) следует не
закрывать внешней петлей, а присоединить к открытой "расширительной
емкости", наполненной растворителем. Растворитель должен быть насыщен,
например, гелием, и хранить его необходимо при постоянной температуре.
Рефрактометрическое обнаружение и градиентное элюирование являются
взаимоисключающими.
3.6.2.2. Общие принципы работы рефрактометрических детекторов. В
современных рефрактометрических детекторах используется один из трех
следующих принципов.
1. Измерение КП путем измерения отклонения луча (рис. 3.16):
сфокусированный луч света проходит через "нейтральное стекло"
(предназначенное для оптической балансировки детектора) - две
параллельные призматические выемки в стеклянном блоке, служащие рабочей
ячейкой и ячейкой сравнения. Если обе ячейки заполнены одной и той же
жидкостью, т. е. если ns=nR, луч света, покидающий ячейку, слегка
смещается вверх параллельно падающему лучу. Если КП в ячейке rts
меняется, выходящий луч тоже меняет свое направление, как показано на
рис. 3.16. Положение луча регистрируется дифференциальным фотодиодом и
настраивается (с помощью нейтрального стекла) таким образом, чтобы сигнал
был сбалансирован, если ns = nR. Выходной сигнал может быть положительным
или отрицательным в зависимости от того, что больше - ns или riR. У
хороших детекторов этого типа уровень шума равен около 5-10-9 А ед. КП.
Аппаратура 127
Рис. 3.17. Принцип измерения коэффициента преломления рефрактометром
Френеля.
фо - интенсивность падающего света; ф! - интенсивность света, прошедшего
за границу раздела стекло - ЖИДКОСТЬ (в
жидкость); фг - ин-тенсивиость отраженного света.
Небольшие изменения Лжидк вызывают изменение а н как следствие изменение
ф|/ф о.
а. град
2. Измерение КП в соответствии с законом Френеля (рис. 3.17): луч
света, падающий на поверхность раздела двух оптических сред (например,
стекло и жидкость), расщепляется на отраженный луч и луч, поступающий во
вторую среду (жидкость). Если угол падения подобран таким образом, чтобы
угол проникания был близок к 90РС (близок к полному отражению), то
небольшие изменения коэффициента преломления жидкости вызовут
значительные изменения интенсивности проходящего луча (рис. 3.17). Это
явление (подробно его описывают уравнения Френеля) используется в
рефрактометрическом детекторе, изображенном схематически на рис. 3.18.
Два параллельных пучка света направляются один в рабочую ячейку, другой в
ячейку сравнения. Небольшие различия в КП образца и жидкости в ячейке
сравнения создают
128 Глава 3
Рис. 3.18. Схема действия рефрактометра Френеля.
1 - источник света;
2 - стеклянная призма; 3 - тефлоновая прокладка с вырезанными для ичейкн
углублениями; 4- стальная пластина; 5 - луч света, проникающий в раствор
пробы (илн раствор сравнения), находящейся в ячейке, и направляемый
полированной поверхностью стальной пластины на фотодетектор 5; 7 *- луч
отраженного света (не используется); 8 - входной и выходной капилляры.
Рис. 3.19, Схема действия интерференционного рефрактометра (рефрактометра
Жамина).
L - длина ячеек для раствора пробы и раствора сравнения; лпр и лср -
коэффициенты преломления раствора пробы и раствора сравнения; разность
длин оптического пути равна разностн фаз Двух интерферирующих пучков
света: Дб =*1 (япр-лср); интенсивность света, поступающего на фотодиод,
меняется от максимума до минимума с изменением Дб от 0 до 0,5-Я.
соответствующее различие в интенсивности света, поступаю-щего из двух
ячеек. Уровень шума такого детектора сравним с уровнем шума детектора
