Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
З.6.1.2. Фактор отклика, нижний предел обнаружения и диапазон
линейности. Если какой-либо параметр элюата, проходящего через детектор,
например, поглощение УФ-излучения при 254 нм, изменяется на определенную
величину АЛ, выходной сигнал детектора также изменяется на величину А5.
Фактор отклика (или чувствительность) Rd в этом случае определяется как
Rd = &SI&A
Нижний предел обнаружения (НПО) -это то минимальное изменение
определяемого параметра, которое способно вызвать изменение сигнала,
достаточное для его надежного распознавания на фоне шумов выходного
сигнала. НПО с учетом вводимого образца можно получить только для всей
хроматографической системы в целом (включая колонку): НПО представляет
собой минимальное количество вещества, вводимого на колонку, которое даст
минимальный пик, различимый на фоне шумов, обычно высота такого пика
должна вдвое превышать уровень шумов.
НПО, представленный как свойство одного детектора, таким образом,
является только характеристикой качества самого детектора. В литературе
часто смешивают понятия чувствительности и НПО.
Диапазон линейности (иногда также называемый линейным динамическим
диапазоном или динамическим диапазоном)
124 Глава 3
представляет собой отношение верхнего предела значений измеряемого
параметра, для которого выходной сигнал сохраняет линейность в пределах
заданного значения (например, 1%), и определенного ранее НПО. Иными
словами, диапазон линейности детектора лежит в таких пределах значений
измеряемого параметра, для которых фактор отклика RD постоянен с заданной
точностью. Следовательно, диапазон линейности охарактеризован полностью
только в случае, если одновременно задан предел допустимых отклонений от
среднего фактора отклика.
3.6.1.3. Количественный и качественный отклик детектора.
Одна из целей применения детектора состоит в получении количественных
характеристик некоторых или всех компонентов разделяемой пробы. Он может
также давать качественную информацию о компонентах пробы. Это имеет место
в том случае, когда детектируемый параметр, который избирательно влияет
на фактор отклика для конкретных компонентов, может быть изменен,
например рабочая длина волн в абсорбционном детекторе, электродный
потенциал в электрохимическом детекторе или установка фильтра массы в
масс-спектрометре. Для абсорбционных детекторов (УФ- и видимого
диапазонов) отношение откликов, полученных при двух и более различных
длинах волн, может оказать значительную помощь при идентификации
компонентов в дополнение к времени удерживания.
3.6.1.4. Вклад детектора в размывание пиков. В ЖХ существует более
или менее эмпирическое правило, иногда называемое железным правилом
хроматографии, которое гласит, что эффект размывания пиков вне колонки не
должен превышать 10% ширины пика. Существуют два фактора, вносящих вклад
в создание этого эффекта: объем ячейки детектора и постоянная времени
отклика детектора; верхний предел эффекта можно определить, исходя из
эффективности колонки. Соединение с коэффициентом емкости k элюируется из
колонки, имеющей п теоретических тарелок и полный мертвый объем Vm( 1+&).
пиком, объем (по нулевой линии) которого Wb определяется выражением
йУб = 4Ул1(1+^)/Ул (для пика, имеющего гауссову форму)
Согласно правилу, приведенному в работе [27], вклад объема ячейки
детектора Vd в процесс размывания полосы несуществен, если
Fo<0,l wb
Аналогичный принцип можно использовать для определения верхнего
предела значения постоянной времени детектора т,
Аппаратура 12&
которая не должна превышать одной десятой ширины основания пика (в
единицах времени):
тг^0,4 VM(l+k)/F^n
Например, для колонки 10 смХ4 мм (внутренний диаметр), заполненной
носителем пористостью 0,8, эффективность которой равна 5000 теоретических
тарелок, для k = 0,5 и максимальной объемной скорости 4 мл/мин объем
ячейки детектора не должен превышать 10 мкл, а постоянная времени
детектора не должна быть более 130 мс.
Следует также обращать внимание на вклад, вносимый в процесс
размывания полосы системами подключения и стыками капилляров. При работе
с высокоэффективными колонками трубки с внутренним диаметром 0,1-0,15 мм
предпочтительнее трубок диаметром 0,25 мм.
3.6.2. Рефрактометрический детектор
3.6.2.1. Общие замечания по применению. Коэффициент преломления (КП)
разбавленных растворов изменяется пропорционально изменению концентрации
растворенного соединения, что можно использовать для количественного
обнаружения последнего в элюате. Зависимость между изменением КП и
концентрации соединения в растворе в очень малой степени определяется
типом растворенного соединения, что делает этот принцип обнаружения
достаточно универсальным, хотя и но слишком чувствительным. Например, при
20 °С и длине волны 589,3 нм КП 0,1%-ного водного раствора сахара (один
из популярных примеров) равен 1,3331, а КП чистой воды равен 1,3330. НПО
(определенный согласно разд. 3.6.1.2) современного рефрактометрического
