Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
методов - классической колоночной, газовой и тонкослойной хроматографии,
к тому времени уже завоевавших признание. Однако вскоре стало очевидно,
что уже отработанные практические приемы могут быть лишь отчасти
использованы в процессе разработки аппаратуры для "современной жидкостной
хроматографии" - таким было первоначальное название этого метода,
поскольку необходимо учитывать целый ряд весьма специфических требований,
обусловленных следующими особенностями методики.
а. Колонки для ВЭЖХ наполняют носителем с очень малым диаметром
частиц. В результате при таких объемных скоростях растворителя, которые
необходимы для быстрого разделения пробы, на колонке создается высокое
давление.
б. Детекторы, применяемые в ВЭЖХ, чувствительны к флуктуации поток
а и давления элюента (шумы). Более того, при применении концентрационных
детекторов необходима еще более высокая стабильность объемной скорости
элюента.
в. Процесс хроматографического разделения сопровождается рядом
антагонистических эффектов, так, например, диспергирование образца в
подвижной фазе ведет к смешению разделяемых компонентов и снижает
максимальную концентрацию вещества в элюируемом пике (в детекторе).
Диспергирование наблюдается на всех участках системы от точки ввода пробы
до детектора.
г. Растворители, выполняющие роль подвижной фазы, часто способны
вызывать коррозию аппаратуры. Это в первую очередь относится к
растворителям, используемым в обращенно-фазовой хроматографии, которая
предпочтительна в биохимических приложениях ВЭЖХ.
Аппаратура 101
з
4
А
Б
В
S
Рис. 3.1. Схема жидкостного хроматографа.
Л. Б, В -резервуары для растворителя; а, б, в -дозирующие краны; 1 -
насос; 2 - кран для йвода пробы; 3 - колонка; 4 - детектор; 5 - емкость
для элюата.
Специфику ВЭЖХ как инструментальной методики необходимо учитывать в
процессе разработки, создания и эксплуатации этих систем. Для создания
коммерческих образцов хроматографических систем и их компонентов,
достаточно надежных, простых и безопасных в работе с приемлемым
соотношением между ценой и техническими характеристиками, потребовалось
более десяти лет поисков и исследований. Наметившиеся в последнее время
тенденции к уменьшению колонок (как длины, так и диаметра) заставляют
предъявлять новые требования к инструментам. Особенно это касается пп.
"б" и "в".
Цель данной главы:
дать определение ряда технических терминов, употребляемых при
описании инструментов для ВЭЖХ;
объяснить основные принципы работы наиболее важных элементов
жидкостного хроматографа;
дать более подробное описание важнейших технических характеристик,
которые влияют на результаты качественного и количественного анализа;
дать рекомендации по наиболее эффективному использованию
инструментов.
На рис. 3.1 схематически изображены основные элементы жидкостного
хроматографа; насос 1 подает один или несколько растворителей из
резервуаров А, Б, В в систему. Состав элюента контролируется дозирующими
кранами а, б, в. Обра-
102 Глава 3
зец вводят в колонку 3 посредством крана 2. Выходящий из колонки поток
элюата непрерывно контролируется при помощи детектора 4, выходной сигнал
которого регистрируется самописцем или другим устройством с целью
дальнейшей количественной и (или) качественной интерпретации. Поступающий
Из детектора элюат накапливается в коллекторе 5.
3.2. Система подачи растворителя
3.2.1. Хранение растворителя
Большинство растворителей, используемых в ВЭЖХ в качество подвижной фазы,
имеют два нежелательных свойства, которые следует учитывать при хранении
их и работе с ними.
а. Многие растворители токсичны. Существует понятие "предельно
допустимая концентрация" (ПДК), под которой подразумевают максимальную
разрешенную концентрацию паров вещества в рабочих помещениях. Данные по
ПДК различных соединений можно найти в справочниках [1, 2]. ПДК
ацетонитрила - растворителя, наиболее широко применяемого в ВЭЖХ,
составляет 40-10-4 %.
Во избежание загрязнения рабочего помещения резервуары для
растворителей в жидкостном хроматографе должны иметь герметичные крышки.
Пространство над растворителем необходимо медленно продувать инертным
газом (который после этого следует пропускать через поглотитель паров
растворителя или направлять в вытяжной шкаф), что предотвратит создание
вакуума в резервуаре и не позволит растворителю поглощать воздух.
б. Обычно в лабораторию поступают растворители, насыщенные
воздухом. Это может привести к различным нарушениям в работе прибора.
Образование воздушных пузырьков в результате спонтанной деаэрации
растворителя (особенно в области впускного клапана насоса) способно
нарушить или даже сделать вообще невозможной его нормальную работу.
Данный эффект особенно усиливается, если температура насоса значительно
выше температуры растворителя в резервуаре. Это объясняется тем, что
растворимость воздуха в водных растворах понижается примерно на 1% с
