Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
использовать химически привитые фазы, но и их стабильность не бесконечна.
Некоторые алкалоиды можно разделять на Cie-привитых фазах при кислотном
pH элюента (фосфатный буфер, pH 2,7) [87]. Альтернативные методы основаны
на использовании ион-парной [87] и ионообменной [88] хроматографии. В
недавних публикациях отмечено, что для разделения определенных классов
алкалоидов следует выбирать кислые элюенты и неподвижные фазы С^. Недавно
появившиеся неподвижные фазы на основе стирол-дивинилбензольных смол
позволяют применять элюенты с высоким pH, что дает возможность добиваться
получения симметричных пиков без добавления в элюент ион-пар-ных
реагентов [89].
Поскольку класс алкалоидов весьма обширен и разнообразен и поскольку
число публикаций, посвященных их разделению при помощи ВЭЖХ, чрезвычайно
велико, мы ограничимся обсуждением лишь тех статей, которые появились в
печати в последнее время.
14.5.1. Пуриновые алкалоиды
Анализ алкалоидов, входящих в состав водных экстрактов чая, был успешно
проведен с использованием ц-бондапака Qg и смеси метанол/0,1 М цитратно-
фосфатный буфер (pH 7,0) (20:80) в качестве элюента [90]. Теобромин,
теофиллин и кофеин были разделены менее чем за 10 мин. Один из общих
методов определения кофеина в овощах и сырье для фармацевтической
промышленности основан па применении Cig-фазы и смеси метанол/вода
(60:40) [91]. Обнаружение осуществляется при
280 нм, внутренним стандартом служит 8-хлортеофиллин. Метод позволяет
проводить одновременное определение теобромина, теофиллина и кофеина.
Вторичные растительные метаболиты 661
Теофиллин (1,3-диметилксантин)-это лекарственное средство,
предназначенное для лечения астмы, терапевтическая активность которого
зависит от его концентрации в крови. Поэтому необходим метод, позволяющий
проводить быстрый количественный анализ теофиллина. Многие из таких
методов основаны на применении ВЭЖХ. Один из них предусматривает
использование С^-фазы партиснл-Ю008-2 и элюирование смесью метанол/0,025
М КН2РО4 (65:35) [92], причем для
анализа достаточно 10 мкл сыворотки крови, которую вводят непосредственно
на предколонку. Обнаружение осуществляют УФ-детектором (254 нм), другие
содержащиеся в пробе ксантины на результаты анализа влияния не оказывают.
14.5.2. Морфиновые алкалоиды
Хотя первая публикация, посвященная разделению морфиновых алкалоидов,
появилась только в 1973 г., в настоящее время число работ, в которых
рассматривается эта проблема, весьма велико. Разделение этих алкалоидов,
как правило, проводят на колонках с обращенной фазой Сis. При разделении
морфина, кодеина и тебаина элюентами служат смеси метанол/0,1 М КН2Р04
(7:43) [94], метанол/0,3 %-ный карбонат аммония
(4:1) [95], ацетонитрил/0,1 М NaH2P04 (1:3 или 1:19 при pH 4,8) [96].
Авторы работы [97] провели одновременное разделение шести основных
алкалоидов, входящих в состав опиума, на обращенной фазе Cis в
изократическом режиме без добавления ион-парных реагентов [97]. Элюентом
служила смесь 1%-ный аммонийацетатный буфер плюс уксусная кислота до pH
5,8 и ацетоннтрил или смесь этого буфера, ацетонитрила и диоксана.
Обнаружение осуществлялось при 254 нм. Этот простой и надежный метод
пригоден для рутинного количественного анализа сырого опиума. Разделение
с прекрасными результатами морфина и наркотолина на С^-фазе при
элюировании смесью метанол/диоксан/0,01 М CH3COONa заняло всего 5 мин
(морфин элюировался перед наркотолином) [98]. Однако если в состав
элюента не входил водный буфер, то порядок элюирования менялся на
обратный. Такой элюент пригоден и для разделения минорных опийных
алкалоидов - палаудина, папаверина и изокорипальмина.
Автор работы [88] исследовал влияние на время удерживания на колонке с
силикагелем ряда опийных алкалоидов изменения полярности элюента,
переходя от нормально-фазовой системы, содержащей 1 % воды, к
ионообменной, содержащей 90% воды. Эффективность использованной им
силикагелевой колонки при элюировании смесью ацетонитрил/вода/ледяная
уксусная кислота/диэтиламин (10 : 90 : 0,5 : 0,5) достигала 6000
теоретических тарелок по тебаину (& = 2,0).
662
Глава 14
0,01 ед погл,
J____________1_
0 2 4
6 810 12 14 16 18 20
Рис. 14.4. Разделение экстрактов Senecio vulgaris [89].
Элюент: ацетонитрил/ОД М водный раствор
аммиака (25 : 75), 1 мл/мин.
14.5.3. Пирролизидиновые алкалоиды
В последнее время пирролизидиновым алкалоидам уделяется большое внимание
из-за их токсичности. Они входят в состав самых различных семейств
растений и вызывают интерес в свете возможного их применения как в
медицине, так и в ветеринарии. Разделению методом ВЭЖХ пирролизидиновых
алкалоидов, содержащихся в различных растениях рода Senecio, посвящена
серия очень интересных статей [99-103]. Один из предложенных методов
предусматривает разделение на ц-бондапа-ке CN и элюирование смесью
ТГФ/0,01 М аммоний-карбонат-ный буфер (pH 7,8) (16:84) [99]. Ретрорсин,
