Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 214

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 208 209 210 211 212 213 < 214 > 215 216 217 218 219 220 .. 296 >> Следующая

(рис. 10.17). Разделение проводилось на колонке размером 90X0,3 см
(внешн. диаметр),за-
Порфирины 517
Рис. 10.18. Разделение стандартных смесей свободных порфиринкарбоиовых
кислот на колонке с силикагелем при градиентном элюировании смесью
ацетон/раз-бавлениая уксусная кислота (нумерация пиков та же, что иа рис.
10.9) [43].
t.MHH
полненной поверхностно-пористым анионообменником AS пел-лионекс SAX.
Элюирование осуществлялось смесью уксусная кислота/метанол в градиентном
режиме - от 0 до 15% уксусной кислоты в течение 15 мин. Указанный элюент
был выбран потому, что его легко выпаривать перед масс-спектрометрическим
анализом полученных фракций [21].
10.3.2.4. Разделение на силикагеле. Моча. В 1976 г. Адамс и др. [36]
опубликовали методику разделения свободных порфиринов мочи на колонке с
силикагелем силика А (13 мкм). Элюентом служил ацетон с 0,3% воды (pH
доводили до 7,6 три-бутиламином). При элюировании этой смесью разделение
происходило в основном по механизму распределительной, а не адсорбционной
хроматографии. Разделение изомеров I и III копро- и уропорфирина
осуществляли в изократическом режиме при объемной скорости 2 мл/мин.
Обнаружение проводили с помощью детектора по флуоресценции, длина волны
возбуждения 403 нм, испускания 627 нм, предел обнаружения составлял 30
пг. Несмотря на высокую чувствительность метода в моче здоровых, а также
больных порфирией были обнаружены только уро-, копропорфирины и небольшие
количества порфиринди-карбоновых кислот. Для мочи больных порфирией
cutanea tarda характерно высокое содержание копропорфирина III. Однако,
как известно, в моче больных этой болезнью содержатся большие количества
уропорфирина и порфирингептакарбоновой кислоты.
Плазма крови. Аналогичные условия были выбраны для хроматографического
разделения свободных порфиринов, содержа-
518 Глава 10
щихся в плазме крови [43]. Порфириновый экстракт растворяли в смеси
ацетон/0,1 М соляная кислота и разделяли на колонке (25x0,3 см) с
силикагелем А. Элюирование проводили в градиентном режиме, повышая в
течение 25 мин концентрацию уксусной кислоты в ацетоне от 2 фо 90%.
Объемная скорость составляла 0,5 мл/мин. Отдельные порфирины после
разделения обнаруживали по флуоресценции (возбуждение при 400 нм,
испускание при 602 нм). При разделении широкоиспользуемой стандартной
смеси, содержащей смесь порфиринов от уро- до мезопорфиринов разрешение
пиков порфиринов с 6-8 карбоксильными группами было довольно плохим. Пики
изомеров I и III копропорфирина разрешены очень слабо.
10.4. Обнаружение
Во введении к данной главе отмечалось, что порфирины обладают очень
характерными спектральными свойствами, поэтому практически все методы их
качественного и количественного определения основаны на использовании
спектрометрии. Поскольку в настоящее время исследователи располагают
различными УФ- и флуоресцентными детекторами, обнаружение порфиринов
после их разделения методом ВЭЖХ можно проводить при таких длинах волн,
которые соответствуют их характеристическому поглощению.
10.4.1. УФ-поглощение
Высокий молярный коэффициент поглощения, отвечающий полосе Соре,
позволяет осуществлять обнаружение элюируемых соединений с большой
чувствительностью. Положение максимума полосы Соре для различных
порфиринов меняется незначительно (табл. 10.1), поэтому на практике
обнаружение проводят при некоторой средней одной и той же длине волны,
лежащей в диапазоне между 400 и 410 нм. Это обеспечивает оптимальную
чувствительность обнаружения практически всех порфиринов. Предел
обнаружения можно понизить, используя порфириноные хелатные комплексы
меди, которые характеризуются максимальным коэффициентом поглощения [56].
Предел обнаружения в данном случае находится на нанограммовом уровне
(около 10 нг) [45]. Непорфириновые соединения также поглощают в области
полосы Соре и могут в ряде случаев мешать обнаружению порфиринов.
10.4.2. Флуоресценция
Метод обнаружения по флуоресценции отличается большей чувствительностью и
селективностью, чем спектрофотометрический. Последнее обусловлено тем,
что конкретные значения ха-
Порфирины 519
Рис. 10.19. Разделение метиловых эфиров порфиринов (2-8 карбоксильных
групп) и обнаружение на основе производной нулевого (а) и второго порядка
(б) сигнала детектора по флуоресценции (нумерацию пнков см. иа рнс. 10.7)
[72].
г,мин
рактеристических длин волн возбуждения и испускания присущи лишь немногим
соединениям или классам соединений [70]. Для обнаружения порфиринов в
большинстве случаев используют длину волны возбуждения в области полосы
Соре, а испускание измеряют при 600-630 нм или применяют светофильтр на
580-600 нм. В результате при таком способе обнаружения в поступающем из
колонки элюате можно обнаруживать весьма небольшие количества порфиринов
- вплоть до 30 пг [36]. Контроль за изменением во времени длины волны
испускания в процессе разделения обеспечивает еще большее увеличение
Предыдущая << 1 .. 208 209 210 211 212 213 < 214 > 215 216 217 218 219 220 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed