Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 181

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 175 176 177 178 179 180 < 181 > 182 183 184 185 186 187 .. 296 >> Следующая

t, мин
Рис. 8.6. Хроматограммы гидролизата гликопротеина из слизистой оболочки
желудка.
Колонка: 250X4 мм; объемная скорость: 0,8 мл/мин; обнаружение: при 215
нм. а - неподвижная фаза: силикагель мерк Si 60, 5 мкм; элюент:
ацетонитрил/Н20 (91%).
б - неподвижная фаза: та же; элюент: 0,5% пиперазина в смеси
ацетонитрил/Н20 (88%). в - неподвижная фаза: аминофаза мерк лихросорб-
амин, 5 мкм; элюент; ацетонитрил/НгО (88%).
дов с другими характерными признаками на индивидуальные соединения
добиться более трудно.
Модифицированные силикагели и привитая аминофаза могут быть успешно
использованы для разделения олигосахаридов (рис. 8.7). Последовательность
элюирования в данном случае обратна наблюдаемой при проведении гель-
проникающей хроматографии: время удерживания возрастает с увеличением
степени полимеризации [35].
Рис. 8.7. Разделение мальто-олнгосахаридов кукурузной патоки.
Колонка: 25X0,4 см; неподвижная фаза: |д,-бс>ндапак углевод; элюент:
ацетоиитрил/Н;0
(89:11); обнаружение: прн
195 нм.
Углеводы 441
8.4.3. Жидко-жидкостная хроматография на неполярной неподвижной фазе,
обращенно-фазовая хроматография
Неподвижные фазы, используемые в обращенно-фазовой жидкостной
хроматографии, например фазы ODS, обладают гидрофобными свойствами,
напротив, углеводы характеризуются относительно высокой полярностью.
Поэтому перед разделением углеводов на обращенных фазах их необходимо
предварительно перевести в неполярные производные. В результате
взаимодействия ароматических групп, введенных в состав углеводов, с
неполярными неподвижными фазами существенно возрастают скорость и
эффективность разделения.
8.4.4. Ионообменная хроматография на смолах в боратной форме
Эффективность разделения углеводов в виде боратных комплексов в
значительной степени зависит от конформации углеводной части комплекса,
числа и типа гидроксильных групп, величины угла между гликольными
группами, а также от pH и температуры.
Аномерные гидроксильные группы характеризуются большим сродством к
борат-иону, чем спиртовые гидроксильные группы. Более того, стабильность
комплексов углеводов и, следовательно, коэффициент емкости зависят от
равновесного соотношения их пиранозной и фуранозной форм. Экваториально-
экваториально расположенные соседние гидроксильные группы образуют более
устойчивые комплексы, чем эваториально-аксиальные. Комплексы с борат-
ионами образуют не только 1,2- но и 1,3-диолы, поэтому происходит
разделение галактозы и фукозы (6-дезоксигалактозы). Эффективность
разделения зависит от pH. Обычно для разделения углеводов в качестве
элюентов применяют 0,01-1,0 М буферные растворы с pH 5-10.
Разделение проводят при повышенных температурах. К сожалению, при
относительно невысоких температурах ряд сахаров может расщепляться.
Некоторые авторы [37] добавляют в боратные буферные растворы диолы (при
умеренных значениях pH сродство диолов и борат-ионов незначительно), с
тем чтобы свести до минимума вероятность щелочной перегруппировки
сахаридов. Однако при умеренных значениях pH при температурах ниже 40 °С
сколько-нибудь заметного расщепления сахаров не происходит. Если
хроматографирование осуществляется в условиях температурного градиента,
разделение происходит успешно. На рис. 8.8 представлена хроматограмма
гидролизата гликопротеина слизистой оболочки желудка, полученная в ус-
442 Глава 8
Рис. 8.8. Разделение сложной смеси углеводов - <фор-мозы".
Колонка: 18X0,6 см; неподвижная фаза: сильноосновная ионо-обменная смола
дуррум, DA-X-8-11, 11 мкм, Пало-Альто, США; элюент: боратный буфер, 0,2-
1,4 М, pH 8,6-9,5; объемная скорость: 0,6 мл/мин; температу* ра колонки:
38-62 °С; обнаружение: при 420 им с использованием послеколоночного
модифицирования периодат-адетнлацето-нов'ым методом.
1\ МИН
ловиях изокрэтического элюирования (тот же гликопротеин, что-и на
хроматограммах, показанных на рис. 8.4 и 8.6).
Возможность разделения нейтральных сахаров, аминосаха-ров и
аминокислот будет обсуждена в разд. 8.5.
Применение боратного метода в целях клинического анализа позволило,
например, установить наличие ганглиозидов сахаров и спинномозговой
жидкости больных нервными расстройствами [38]. Для проведения массовых
клинических анализов необходима эффективная методика разделения
компонентов анализируемой смеси. Вследствие высокой специфичности орсин-
сернокис-лотного метода обнаружения подготовку проб для клинического
анализа можно упростить и ограничиться удалением из нее белков с
молекулярной массой, большей 103 Д (например, при помощи фильтрации на
ультрамембранах).
8.4.5. Гель-проникающая хроматография (ГПХ)
ГПХ наиболее пригодна для разделения смесей углеводов, различающихся по
молекулярной массе. Следует, однако, заметить, что для ГПХ при высоком
давлении можно использовать всего
iu
30
15
Рис. 8.9. Разделение гидролизата гликопротеина из слизистой оболочки
желудка.
Элюент: 0,4 М боратный буфер, pH 9,3; температура колонки: 55 °С;
Предыдущая << 1 .. 175 176 177 178 179 180 < 181 > 182 183 184 185 186 187 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed