Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
выше [16].
8.2.2. Жидко-жидкостная хроматография
Разделение углеводов методом жидко-жидкостной хроматографии при низком
давлении традиционно проводилось на целлюлозе. Однако в настоящее время
целлюлоау вытеснили ионообменные смолы, на которых можно осуществлять
разделение при повышенном давлении [6, 17, 18]. Так, например,
установлено, что смолы на основе полистирола, сшитого дивинилбензолом,
содержащие разнообразные противоионы, обладают необходимой механической
прочностью и могут служить неподвижной фазой в ВЭЖХ. Следует отметить,
что относительное содержание воды в таких неподвижных фазах выше, чем в
подвижной фазе, если в качестве последней используются водно-органические
смеси, например водно-зтанольные, поэтому полярные молекулы углеводов
удерживаются неподвижной фазой.
Для разделения углеводов успешно применяются как анио-но-, так и
катионообменные смолы. Однако в большинстве статей описывается разделение
на сильнокислотных катионообмен-никах, содержащих сульфогруппы. Такие
носители широко используются, в частности, в аминокислотных анализаторах.
Противоионами для катионообменников служат кальций, барий-, литий-,
натрий- и калий-ионы, а также органические основания, например метил-,
диметил- и триметиламмониевые ионы.
В качестве противоионов для анионообменников предпочтительны сульфат-
и хлорид-ионы. В общем случае коэффициент емкости неподвижной фазы k
зависит от структуры молекулы углевода, числа содержащихся в ней
свободных гидроксильных групп и ее стереохимии. Коэффициент емкости
увеличивается с увеличением числа гидроксильных групп в молекуле
углевода. Кроме того, он зависит от температуры колонки. Оптимальной
температурой, если исходить из длительности анализа и эффективности
разделения, является температура 80°С и выше [19]. На разделение
углеводов влияет их взаимодействие с противоионами, а также ситовый
эффект, обусловленный особенностями строения матрицы ионообменной смолы
[19].
Скоростное разделение в условиях жидко-жидкостной хроматографии обычно
проводится на устойчивых к высокому давлению неподвижных фазах. Успешно
применяются неподвижные фазы на основе немодифицированных силикагелей, на
которые непосредственно в процессе разделения наносится тонкий слой
Углеводы 431
воды или водного раствора полифункциональных аминов [15, 21]. Однако в
этом случае выбирать элюент следует достаточно осторожно, поскольку
относительное содержание воды в элюен-те должно быть небольшим, а
углеводы, как известно, плохо растворимы в большинстве органических
растворителей. Немо-дифицированные силикагели, кроме того, могут
неспецифически взаимодействовать с углеводами, что снижает
воспроизводимость результатов разделения.
Проводя разделение на неподвижных фазах с химически привитыми амино-
или другими полярными группами, например диольными, можно избежать этих
трудностей [22, 23]. В этом случае элюирование проводят смесями
ацетонитрила (<70%) или этанола (<70%) с водой. В работе [24] описаны
такие неподвижные фазы, которые позволяют применять в качестве элюентов
водно-органические смеси с содержанием органического растворителя менее
40%.
8.2.3. Ионообменная хроматография
Нейтральные сахара имеют исключительно низкую кислотность. Проводить
разделение сахаров, исходя из их способности к образованию ендиолятов, не
представляется возможным, так как в результате возможной изомеризации
идентификация пиков может быть неоднозначной.
В то же время кислые или основные сахара с успехом можно разделить при
помощи ионообменной хроматографии [25-27]. Последовательность элюирования
сахаров зависит от их р/С, концентрации противоионов в элюенте, pH
элюента и температуры. Кроме того, жидко-жидкостная и гель-хроматография
имеют ряд своих характерных особенностей, которые необходимо учитывать.
Разделение сложных смесей углеводов лучше всего проводить на
сильноосновных ионообменных смолах в боратной форме при использовании в
качестве элюента боратных буферных растворов. Этот метод был предложен
Кимом и Зиллом [8] и позднее с успехом использован рядом авторов [9, II,
28-30].
Углеводы образуют анионные комплексы с борной кислотой [34]; этим
свойством обладают все соединения, имеющие у соседних атомов углерода
гидроксильные группы, лежащие в плоскостях, угол между которыми не
превышает 60°. Устойчивость этих комплексов и их кислотность зависят от
пространственного расположения гидроксильных групп (цис или транс,
экваториального или аксиального) [10]. Элюируют боратные комплексы
углеводов 0,05-1,0 М буферными растворами на основе борной кислоты (pH 7-
10) как в изократическом, так и в градиентном режимах [9, 28-30].
432 Глава 8
8.3. Обнаружение
Для обнаружения незамещенных углеводов высокочувствительные детекторы,
обычно применяемые в ВЭЖХ, практически непригодны, поскольку в молекулах
этих соединеннй не содержатся соответствующие функциональные группы.
Например, УФ-детекторы в данном случае могут работать лишь при длинах
