Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
ми от А до 60% Б за 50 мин
ц-Бондапак Ci8 А: 0,02 М триэтиламинфосфатный буфер (pH "
УФ (210)
3,0), Б: 0,02 М триэтиламинфосфатный буфер
(pH 3,0)/2-пропанол (1 : 1), линейный градиент
от А до Б за 75 мин (1 мл/мин)
(1-МСГ13_22
Лихросорб RP-8 А: 0,1 М фосфатный буфер (pH 2,1), Б: ацето 4,6X250
УФ (200)
(5 мкм) нитрил, градиент специального профиля от А
до Б (2 мл/мин)
326
Глава 5
Рис. 5.26. График зависимости \ogk от величины поверхностного натяжения
для АКТГ1-24 [43].
Неподвижная фаза: ц-бондапак Ci*:
элюент: ацетонитрил/вода/50 мМ
NaH2P04 (pH 2,5 установлен добавлением ортофосфорной кислоты); объемная
скорость: 1 мл/мин. Разделение проводилось в изократиче-ских условиях с
увеличением концентрации иа 2% при каждом последующем измерении.
обращенно-фазовой хроматографии имеет место следующее соотношение между
коэффициентом емкости k и величиной поверхностного натяжения 7 элюента
[35]:
log kt = С+ч (МАЛ + 4,836 ЛП/з(k- 1) VmW) /RT
где ДЛ- относительная площадь контакта молекулы растворенного соединения
с поверхностью неподвижной фазы, С - константа, N - число Авогадро,
микроскопический коэффициент емкости, Vm - средний молярный объем
подвижной фазы, #- универсальная газовая постоянная, Т - абсолютная
температура.
Это линейное соотношение между log? и 4 подтверждено экспериментально
на примере разделения АКТП^ на обра-щенной-фазовой колонке с ц-бондапаком
Cis при элюировании смесью ацетонитрил/вода (рис. 5.26) [43].
Таблица 5.18. Влияние органических модификаторов подвижной фазы на время
удерживания свиного АКТГ, АКТГ ,_24 н а-МСГ [14]
Колонка: 100X5 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: гиперснл-ODS (5
мкм); элю-ент* А-0,2 М ЫаН2Р04/НзР04 (pH 2,1), Б - органические
растворители, указанные ниже; обнаружение: по поглощению в УФ-области
(при 225 им): органические растворители ж пользовались в качестве второго
компонента простого линейного градиента (50 мин) с постоянной скоростью
изменения состава, равной 2%/мии
Пептид Ацетонитрил Тетрагидро- Диоксаи Мета иол
фуран
АКТГ,. 24 13,6 13,0 15,4 26,0
АКТГ (свиной) 18,5 20,6 25,4 .•5,4
а-МСГ 15,2 15,4 18,0 28,4
Пептидиые гормоны 327
Рис. 5.27. Влияние концентрации ацетонитрила на значение k при разделении
АКТГ1-24 и АКТГ5-10 методом ВЭЖХ [14].
Колонка: 100X5 мм (внутр. дна-
метр); неподвижная фаза: гипер-сил-ODS, 5 мкм; элюент: 0,2 М
Na2HPO*- Н3РО4 (pH 2,1)/ацето-ннтрил (концентрации различные, указаны на
рисунке), изохратиче-ское элюирование; объемная скорость: 1,5 мл/мин;
обнаружение: по поглощению при 225 нм.
[CHjCN], %
Время удерживания пептидов, имеющих структуру АКТГ, как и у других
полипептидов, зависит от полярности органического модификатора подвижной
фазы (табл. 5.18).
Эффективное разделение пептидов, молекулы которых близки по размерам к
молекулам АКТГ, достигается только в том случае, если диапазон
концентраций органического растворителя невелик. При более высоких
концентрациях органического растворителя полипептиды элюируются очень
быстро, а при низких концентрациях - прочно связываются с обращенной
фазой, как это наглядно показано на рис. 5.27 на примере двух пептидов с
аминокислотной последовательностью природного Актг:
Как уже говорилось в разд. 5.2.1, автор работы [15] предложил метод
предсказания коэффициентов удерживания. С целью проверки применимости
этого метода для изократи-ческого элюирования с использованием различных
подвижных фаз были определены коэффициенты емкости ряда производных АКТГ.
Последующее сравнение теоретически рассчитанных и экспериментально
найденных значений этих коэффициентов показало их хорошее соответствие
(табл. 5.19, рис. 5.28) [86].
Как видно из табл. 5.15, аминокислотные последовательности
человеческого и свиного АКТГ отличаются только в положении 31. Остаток
Leu в свином гормоне заменен на остаток Ser в человеческом. Успешное
разделение этих гормонов при помо-
828
Глава 5
Рис. 5.28. Корреляция между экспериментально установленными и
рассчитанными [15] значениями k для производных АКТГ (АК.ТГ ,5-32, АКТГ
,-32, АКТГ,-,4, АКТП-24 И АКТГ 1-2в) [86].
Колонка: 250X4,6 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: нуклеосил 10
С**; элюен-ты: 1 - ацетоннтрнл/метанол
(16,7: 83,3)/0,1 М раствор сульфата натрия в 0,01 М фосфатном буфере, pH
