Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Аналогичный метод пригоден также для определения пареп-тида (и-пролил-
Ы-метил-р-лейцил-глицинамида) - аналога МИГ, который имитирует
физиологическую роль последнего [63].
5.3.2. Нейрогипофизарные пептидные гормоны
Известны семь нейрогипофизарных пептидных гормонов, которые образуются в
nucleus supraopticus и nucleus paraventicu-laris гипоталамуса (табл.
5.11), и, пожалуй, ни одной группе гормонов не посвящено столько
фундаментальных исследований по разделению методом ВЭЖХ [2, 3, 11, 14,
15, 17, 43, 56, 59, 62, 72, 79, 80-86]. Условия разделения этих гормонов
методом ВЭЖХ и их структура указаны в табл. 5.12.
Как следует из табл. 5.13 и рис. 5.20, значения k зависят от величины
pH и ионной силы элюента. Варьируя эти два параметра, можно подобрать
такие условия, при которых нейрогипофизарные гормоны разделяются с
хорошим разрешением [3].
Элюирующая сила растворителя определяется тремя типами межмолекулярных
взаимодействий: дисперсионными, ориентационными и водородными связями
[87]. Поэтому относительное
Таблица 5.11. Структуры природных нейрогипофизарных пептидных
гормонов
Структура Название
1 1 Аргиннн-вазотоцнн
H"Cys-Tyr-Ile*Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2
1 2345 6789
H-Cys-Tyr-Ile-Ser-Asn-(ys-Pro-Gln-C.ly-NH2 Глумитоцин
1 2 3 4 5 6 7 8 9
H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly NH2 Лизин-вазопрессин
123456789
H-Cys-Tyr-Phe-GIn-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NHj Аргинии-вазопрессин
123456789
H-Cys*Tyr-IIe-Gln-Asn-Cys-Pro-lle-Gly-NH2 Мезотоцин
1 2345 6789
l i Изотоцин (Ихтнотоцин)
H-CyS'Tyr-lIe-Ser-Asn-Cys-Pro-ne-GIy-NH2
12 3 4 5 6 7 8 9
H-Cys-Tyr-lle-Gln-Asn-Cvs-Pro-Leu-Gly-NH2 Окситоцин
1 2345 678 9
к
20 "
pH
Рис. 5.20. Влияние величины pH на значения k окситоцниа н производных
вазопрессина при разделении методом ВЭЖХ [3]-
Неподвижная фаза: нуклеосил Ci">
10 мкм-, элюент: 20% ацетонитрила в
0,02 М фосфатном буфере (Серенсен), pH от 5,0 до 8,0; 20% ацетоиитрнла в
0,02 М боратном буфере (Серенсен) pH от 8,0 до 11,0; в обе подвижные
фазы добавлен хлорид иатрня до концентрации 0,05 М.
1 - фелипрессин; 2 - демокситоцин; 3 - окснтоцин; 4 - лнзив-йазопрессин;
5 - орнипрессин.
Пептидные гормоны 295
Рис. 5.21. Зависимость относительного удерживания а от природы
органических модификаторов различных систем растворителей [85].
Колонка: 300X3,9 мм (внутр. диаметр): неподвижная фаза: р.-бондапак
Сц',
элюент: А-0,05 М ацетат аммоння (pH 4,0), Б -14% тетрагидрофурана или
22% ацетонитрила, нли смесь 36% метанола ллюс растворитель А до 100%;
обнаружение: по поглощению в УФ-области.
] - аргинин-Яазотоцнн; 2 - глутомнции; 3 - лизин-вазопрессии; 4 -
аргнннв-ва-зопрессин; 5 - мезотоцин; 6 - иэотоцнн;
удерживание структурно близких нейрогипофизарных пептидных гормонов
сильно зависит от органического растворителя, содержащегося в подвижной
фазе (рис. 5.21) [85].
Обнаружение, например, окситоцина по поглощению в УФ-области позволяет
определять гормон в растворах, содержащих 1 международную единицу
активности в 1 мл (табл. 5.14). В то же время ввод больших объемов может
привести к уширению зон [80].
Рис. 5.22. Влияние различных растворителей на реакцию флуорескамииа с ок-
ситоцииом [21.
Холостой опыт: 5 мл буфера (pH 9,0, титризол, Мерк)+4 мл воды+5 мкл
раствора окситоцина (200 межд. ед./ил)*Н мл флуорескамииа (30 мг/100 мл
ацетонитрила). На графике указаны истинные значения за вычетом
результатов холостого опыта.
Таблица 5.12а. Условия разделения методом ВЭЖХ нейтрогипофизарных
пептидных гормонов и их производных
Обнаружение (нм) Литера
Неподвижная фаза Элюент мм k тура
Окситоцин
Si 60 (5 мкм) Тетрагндрофуран/0,05 М уксусная кислота (2:1) 3X250
Флуоресценция 0,4 2
3X250 (флуорескамин) 3,9
RP-8 (10 мкм) Фосфатный буфер (pH 7)/ацетонитрил (4:1) УФ (215)
3
Фосфатный буфер /pH 7)/ацетоиитрил (33:7) 3X250 УФ (215)
9,0 3
Нуклеосил Сд Фосфатный буфер (pH 7)/ацетонитрил (4:1) 3X150 УФ
(215) 7,0 3
(5 мкм) Фосфатный буфер (pH 7)/ацетонитрил (3:1) 3X150 УФ
(215) 2,2 3
Фосфатный буфер (pH 7)/ацетоиитрил (4: 1) 3X150 УФ (215)
7,3 3
ODS (Биорад) А: 5 мМ фосфатный буфер+0,1 М NaClO* УФ
(200, 220), 36,4 (время 15
