Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Подкисленный ацетон (Юх)->-Осаждение белков
I
Уравновешивание в течение ночи
J
Центрифугирование (27 ООО g, 20 мин)
1
Удаление ацетона N2
1
Диэтиловый эфир (2х)-"-Липиды
1
Пептиды
I
Сеп-пак (миниколоика с 005)-*-Соли, сахара и др.
| Ацетоиитрил Биобедс SM2
I Полистирол-дивииилбензольный
I сополимер (4 г), метаиол
Сеп-пак (миниколонка с ODS)
Ацетоиитрил
ВЭЖХ
I ц-Боидапак Cis. формиат
I трнэтиламина (70%)
МС с ионизацией электрическим полем Рис. 5.11.
Подготовка пробы для "пикомольной процедуры [60].
тостатина. В результате разделения этого продукта на сефа-дексе G-25 при
элюировании 2 М уксусной кислотой получают три фракции, которые исследуют
методом ВЭЖХ (рис. 5.13). Основной пик фракции II совпадает с
соответствующим пиком контрольного образца. Дальнейшая очистка этой
фракции методом полупрепаративной ВЭЖХ дает очень чистый продукт,
гомогенность которого подтверждают ВЭЖХ (рис. 5.14), ТСХ в семи различных
системах растворителя, электрофорез и аминокислотный анализ.
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Ttir Ser Cys
Бок-
Бок-
Бок-
Trt
.Trt
Trt
Бок
Бок
Бок
OCH, Адпок
МН,-МИ, (J 12,24)
NHNHj Азид
Бок
,Бок
Бок
Ви*
,Ви*
But
). 12/метанол-ДМФ(4:1)
2. НС1 (32/?-ная.0°С,М2.8мин)
/But
Ви1
.Ви1
,Ви'
Ви'
Ви'
.Trt
он
.Trt
Y- он
Л
Н -ftla-Gly-Cys- Lys-Asn-Phe-Phe_Trp-Lys-Thr_Phe-TIii-Ser-Cys -OH Рис.
5.12. Синтез соматостатнна путем конденсации 7+7 фрагментов [75, 76].
Фракция I
10 8 6 4 2 О
t.MKH
Рис. 5.13. Хроматограммы грубого экстракта синтетического соматостатнна
после его предварительной очистки [73, 76].
Предварительная очистка. Колонка: 800X6 мм (внутр. диаметр); неподвижная
фаза: се-фадекс G-25; элюент: 2 М уксусная кислота.
Разделение. Колонка: 250X4.6 мм (внутр. диаметр); неподннжная фаза: RP-8,
10 мкм; элюент: нэопропаиол/0,01 М ацетат аммония, pH 4.4 (35:65);
объемная скорость:
1.5 мл/мнн; данление: 210 бар; температура; 25 °С; обнаружение: по
поглощению при 254 нм.
Пептидные гормоны 289
Рис. 5.14. Хроматограмма чистого сома-тостатина (условия разделения см. в
подписи к рис. 5.13) [75, 76].
Этот успешный синтез соматостатина стал возможен только благодаря
разработке нового способа защиты аминогрупп при помощи группы Адпок,
которую можно удалить в очень мягких кислотных условиях, тогда как
реагенты, предназначенные для удаления обычно применяемой группы Бок
(грег-бутилокси-карбонил) с Бок-Тгр-пептидов, вызывают алкилирование ин-
дольного кольца триптофана, что дает биологически неактивные пептиды
[68].
Именно ВЭЖХ позволила выявить преимущества защиты при помощи группы
Адпок по сравнению с другими методами защиты аминогрупп. Перечислим
некоторые из них.
Остатки Адпок присоединяются к аминогруппам с высоким выходом;
модифицированные Адпок аминокислоты представляют собой кристаллические
соединения, сохраняющие устойчивость в течение месяцев при комнатной
температуре; модифицированные Адпок аминокислоты устойчивы к действию
света; группы Адпок удаляются в очень мягких условиях; группы Адпок можно
удалить в 1000 раз быстрее, чем группы Бок, что позволяет проводить
селективное отщепление; группы Адпок предотвращают атаку на иидольное
кольцо триптофана.
Данные, полученные при исследовании кислотного отщепления групп Адпок
методом ВЭЖХ и масс-спектрометрии, положены в основу предполагаемого
механизма этой реакции (рис. 5.15).
Группы Бок в Ы'-положении имеют в два с лишним раза большую
стабильность, чем в 1Ча-положении, Используя для снятия защиты смесь
уксусная кислота/муравьиная кислота (83%)/вода (7:1:2), можно проводить
избирательное отщепление групп Адпок в присутствии групп N'-Бок (рис.
5.18).
В табл. 5.9 приведены время полупревращения, время 99,9%-ного
отщепления и константы скорости k', в различных кислотных растворителях,
определенные методом ВЭЖХ.
19-1489
и
СН3 О R C-0-C-NH-CH -соон
I
СИ,
н
СН, О(r) R
NH -СН -СООН
СН,
гп_?нз Г ty- с-о-с-
