Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 116

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 110 111 112 113 114 115 < 116 > 117 118 119 120 121 122 .. 296 >> Следующая

(D-His2) -ТРФ [69].
Колонка и неподвижная фаза: см. подпись к рис. 5.8; элюеит (см. текст и
подпись к рис. 5.6): А--0,1 М ацетат пиридина, pH 3,2 (15 мни), ? - 0,2 М
ацетат пнридниа, pH 3,5 (45 мин), В - 0,3 М ацетат пиридина, pH 4,0 (60
мин), Г - 0,6 М ацетат пиридина, pH 4,2 (60 мин), Д-1,0 М ацетат
пиридина, pH 4,6 (80 Мин); температура: 43°С; давление: от 70 до 90 бар;
объемная скорость: 1,5 мл/мнн; обнаружение; с ниигндрниом (570 нм) после
частичного гидролиза (5%, с 5 М NaOH); проба: 8,7 (а) н 250 мг (б).
затор позволяет выделить и очистить из этой смеси 20 различных продуктов
реакции, чистота которых достаточна для дальнейшей работы по установлению
их структуры.
На рис. 5.8 сравниваются хроматограммы, полученные при препаративном
разделении ТРФ и (D-His2)-ТРФ. Из хроматограммы (D-His2) ТРФ видно, что
образец ТРФ содержит примерно 8% природного гормона. Согласно некоторым
литературным данным [46], (D-His2)-ТРФ должен обладать значительной
биологической активностью. В то же время хроматографически чистый (D-
His2)-ТРФ совершенно неактивен. Это доказывает, что препаративный
пептидный анализатор (рис. 5.6) пригоден также для препаративного
разделения диастериомеров пептидов [69].
Пептидные гормоны 285-
5.3.1.2. Люлиберин. Как и в случае с ТРФ, в последние годы появились
многочисленные сообщения о разделении люлиберина методом ВЭЖХ [4, 15, 50-
52, 56, 59-61, 64, 66, 70, 71]. Ввиду того что молекула люлиберина имеет
две ароматические боковые цепи, это соединение можно обнаруживать
количественно (при наномолярной концентрации) по поглощению при 254 им
[52]. Метод ВЭЖХ достаточно чувствителен, в частности, он позволяет
показать, что большинство поступающих в продажу пептидов, в том числе и
люлиберин, не совсем чистые. При помощи метода ВЭЖХ можно обнаруживать
даже очень малые количества примесей, примером тому служит хроматограмма,
полученная при разделении 0,5 мкг люлиберина и 94 мкг (D-His2)-люлиберина
(рис. 5.9) [50].
5.3.1.3. Соматостатин. Вследствие сравнительно малого молекулярного
веса тетрадекапептид соматостатин также лучше всего очищать методами
обращенно-фазовой хроматографии, как это показывают результаты
многочисленных работ [4, 7, 14, 15, 43, 50, 52, 53, 55, 56, 59-61, 64,
72-74]. Насколько высока эффективность разделения обращенно-фазовой ВЭЖХ,
показывает хроматограмма, полученная при разделении синтетической смеси
десяти пептидов гипоталамуса, включая соматостатин. Эти десять
синтетических ол иго пептидов, в цепи которых содержится от 3 до 31
аминокислотного остатка, можно разделить всего за 78 мин, причем
чувствительность разделения составляет 5 мкг (рис. 5.10) [55].
Хромато-масс-спектрометрия с ионизацией электрическим полем позволяет
определять в биологических тканях пикомольные количества эндогенных
олигопептидов, типа соматостатина [60]. Авторы указанной работы
использовали новую буферную систему разбавленный триэтиламин - муравьиная
кислота, что позволило им определять соматостатин в фемтомольных
концентрациях [60]. На рис. 5.11 приведена схема, иллюстрирующая эту
"пикомольную" процедуру.
Метод ВЭЖХ все чаще и чаще используется в таких лабораториях, где
занимаются синтезом пептидов с целью контроля чистоты промежуточных и
конечных продуктов, а также кинетическими исследованиями, см., например,
работы [75, 76]. Цистинсодержащий тетрадекапептид был получен путем
конденсации 7+7 фрагментов (рис. 5.12). Защищенный по N-koh-цу азид
гептапептида был присоединен к гептапептиду, с С-кон-ца которого была
удалена 1-(1-адамантил)-1-метилэтоксикар-бонильная защитная группа Адпок
[75, 76].
Окисление этого защищенного тетрадекапептида иодом в смеси
метанол/ДМФА (4:1) с последующей кратковременной обработкой соляной
кислотой (0°С, 10 мин, раствор, насыщенный азотом) приводит к образованию
грубого экстракта сома-
Рис. 5.9. Разделение (0-Н152)-люлиберина и люлнберина методом ВЭЖХ [50].
Колонка; 600X4 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: м-бондапак Ci", 10
мкм; элюент: 17% ацетоннтрнл/0,01 М ацетат аммония (pH 4,0); объемная
скорость; 2,5 мл/мин;
обнаружение: при 210 нм; количество: -------94 мкг (0-Н!8*)-люлнберина,
- - - 94 мкг
'(0-Н132)-люлнбернна+1 мкг люлнберниа.
Рис. 5.10. Хроматограмма смеси синтетических олигопептндов гипоталамуса
[55].
Колонка: 300X4 мм (внутр. диаметр); неподвижная фаза: ц-боидапак Си;
элюент: А - трнэтиламнифосфорная кислота, (pH 3,2), Б -
триэтнламинфосфорная кнслота/ацетоннт-рил (4:6), линейный градиент от 2
до 70% Б за 78 мни; объемная скорость; 1,5 мл/мии; обнаружение: прн 210
нм; количество: по 2 мкг каждого пептида.
/ - ТРФ; 2 - мет-энкефалнн; 3 - брадикииин; 4 - аигиотенсин И; 5 -
эледозннсвязаниый пептид, б-TyrflSS, 7 - вещество Р, 8 - соматостатин, 9
- Туг1* SS, 10 - (3-эндорфин.
Пептидные гормоны 287 7
г ткани, 1 М уксусная кислота (2х)
Гомогенизация, обработка ультразвуком
Предыдущая << 1 .. 110 111 112 113 114 115 < 116 > 117 118 119 120 121 122 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed