Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
3 Ультрафильтрация, мембрана UM-3 294 ООО 71 г 3
4 и 5 Двукратиаи гель-проиикающая хро 286 ООО 16 г 16
матография: сефадекс G-25, 0,5 М
уксусная кислота 280 ООО 246 мг 800
6 и 7 Двукратная распределительная хро
матография: 0,01%-ная уксусная
кислота/к-бутанол/пиридин (11 : 5 : 3) 4,2 мг 30 500
8 и 9 Двукратная адсорбционная хромато 275 ООО
графия: иорит, вода/этанол/фенол 2,0 мг 58 500
10 Распределительная хроматография: 273 ООО
н-бутанол/уксусная кислота/вода
(4:1:5) (верхняя фаза) 1,0 мг
11 Повтор стадии 10 270 000 57 000
\
Пептидные гормоны 269
ке, значительно более простой, чем применявшаяся 10 лет назад [48].
Авторы работы [49] воспользовались сходной методикой для выделения
соматолиберина (рилизин-фактора соматотропина) яз опухоли поджелудочной
железы человека [49]. Ткани опухйли экстрагировали 0,3 М соляной
кислотой, пропускали экстракт через колонку с сефадексом G-75 и далее
проводили разделение методом ВЭЖХ на двух последовательно соединенных
колонках с обращенными фазами (вторая колонка: 250X4 мм внутр. диаметр,
неподвижная фаза: ультрасфер Cie, 5 мкм) [49].
В настоящее время опубликован ряд подробных исследований по разделению
гормонов гипоталамуса методом ВЭЖХ [50-63]. Информация об условиях
разделения приведена в табл. 5.7.
Объединяя гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25, противоточную
экстракцию, хроматографию на КМ-целлюлозе, распределительную
хроматографию на SE-сефадексе и ОФ-ВЭЖХ (|л-бондапак Ci8, вода,
ацетонитрил, 2-пропанол), группа ученых под руководством Шалли [57]
выделила десять пептидов (Arg-Phe, Phe-Tyr, Val-Trp, Tyr-Phe, Lys-Phe-
Tyr, Gly-Lys-Val-Asn, Phe-Glu-His-Glu, Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-
Phe, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr-
Thr-Lys-Thr-Tyr-Phe-Pro-His-Phe-Asn-Leu), некоторые из них проявили
биологическую активность.
5.3.1.1. Тиреолиберин (ТРФ). Для ТРФ, самого маленького пептидного
гормона, ОФ-ВЭЖХ представляет собой наиболее эффективный из числа
известных в настоящее время метод анализа и разделения [15, 50, 52, 55,
56, 60-62, 64-66]. Это подтверждает, в частности, тот факт, что указанным
способом можно определить 0,7% (D-His2)-изомера тиреолиберина в
присутствии тиреолиберина (рис. 5.2) [50].
Несмотря на то что молекула тиреолиберина не содержит хорошо
поглощающей хромофорной группы, ее разложение в водных растворах можно с
успехом наблюдать по поглощению при 215 нм (рис. 5.3) [52].
Улучшить разрешение можно путем использования лигандообменной
методики, основанной на комплексообразовании с ионами Си2+, что
демонстрируют, в частности, рис. 5.4 и 5.5, на которых показаны
хроматограммы, полученные при разделении четырех изомеров
пироглутамилгистидил-3,3-диметилпро-линамидных производных ТРФ.
В принципе любую методику аналитического разделения посредством ВЭЖХ
можно масштабировать в препаративную [67] или полупрепаративную [68].
Сравнение ряда параметров аналитических и препаративных колонок для ВЭЖХ
приведено в табл. 5.8.
Таблица 5.7. Условия разделения гормонов гипоталамуса и их производных
методом ВЭЖХ (структуры см. в табл. 5.4 и 5.5)
Неподвижная фаза Элюент Колонка,
Обнаружение (нм) k Лите
мм
ратура
Тиреолиберии
ц-Боидапак С]8 Ацетопитрил/0,01 М ацетат аммоиия (pH 4,0) 4x300
УФ (210) --- 50
(10 мкм) (0,5:99,5), (3 мл/мин)
Неподвижная фаза 0,1%-ная уксусная кислота/метанол (2:3), 3,9X300
УФ (215) 52
для анализа жир 1,5 мл/мин
ных кислот фирмы
Waters (10 мкм)
ц-Боидапак CiB А: триэтиламинфосфориая кислота (pH 3,2), 4X300
УФ (210) 1,18 55
(10 мкм) Б: триэтиламиифосфорная кислота (pH 3,2) /
(^A=^R---(о)
ацетоиитрил 40 : 60, градиент от 2 до 70% Б
за 78 мни (1,5 мл/мин)
