Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
таких элементов, как С, Н, О и N, то относительные концентрации можно
легко превратить в абсолютные.
Достоинство метода отношения Р/В в применении к биологическим материалам
заключается в том, что различные поправки, используемые в методе трех
поправок, играют значительно менее важную роль. Поскольку предполагается,
что процентная доза характеристического рентгеновского излучения,
поглощенного в образце, такая же, как и для излучения фона, фактор
поглощения (Л) отпадает. В биологическом материале эффект атомного номера
(Z) мал, и в любом случае им пренебрегают, так как он по предположению
оказывает одинаковое влияние на пик и непрерывное излучение. Поскольку у
биологического материала низкий атомный номер, эффект вторичной
флуоресценции (F) мал и его можно рассматривать как поправку второго
порядка. Как в [165], так и в [166] показано, что результаты измерения
P/В нечувствительны к эффективности детектора, флуктуациям тока пучка и
неточностям коррекции "живого" времени. Кроме того, результаты измерения
Р/В менее чувствительны к изменениям геометрии поверхности, часто
(7.77)
Ci = kl (Р/В){,
(7.78)
76
Г лава 7
наблюдаемой у массивных образцов, особенно в аналитической системе с
большим углом выхода. Оценка показала, что на сравнительно плоских
образцах, например гладких поверхностях излома, можно получить точность
±10%.
7.7.3.4. Заключение
Несмотря на встречающиеся трудности, некоторые исследователи пытались
провести количественный анализ массивных биологических материалов с
использованием одной или более из трех процедур коррекции, которые были
изложены. Однако неизбежная шероховатость поверхности образца, повышенная
глубина проникновения пучка, низкое пространственное разрешение (5-10
мкм) и относительно низкая точность метода (10-20%) в сочетании с
сомнительной справедливостью техники введения поправок для легких
элементов в органической матрице приводят к тому, что обычный анализ
массивных биологических материалов используется значительно реже других
количественных методов, описываемых ниже. Единственным исключением может
служить применение процедур при анализе замороженных в гидратированном
состоянии тканей с использованием в качестве эталонов замороженных
растворов солей.
7.7.4. Толстые срезы на массивных подложках
Анализ срезов на толстых подложках требует особого внимания, если
необходимо сравнивать интенсивности рентгеновского излучения от среза
плюс подложка с интенсивностью рентгеновского излучения от массивного
эталона. Имеются две методики коррекции-В1СЕР и BASIC [188, 189], которые
можно использовать для количественного, анализа срезов на массивных
подложках. В основе метода BICEP лежит тонкопленочная модель [130], и он
разработан для расчета отношений концентраций присутствующих элементов, в
то время как метод BASIC можно использовать для получения локальных
массовых долей элементов. Эти методы, однако, имеют ограниченное
применение в анализе биологических объектов из-за трудности приготовления
образцов равной толщины и того факта, что в различных частях образца
имеются значительные вариации плотности биологического материала. Другие
недостатки заключаются в том, что органическая матрица предполагается
целиком состоящей из углерода (это не имеет места в замороженных в
гидратированном состоянии срезах) и что требуется проводить измерения
всех элементов, присутствующих в концентрациях более 1-2%. Оба метода
сложны в использовании, для реалы
Количественный рентгеновский микроанализ
77
зации требуются большие вычислительные машины; наметилась тенденция к
постепенному вытеснению их методами, использующими срезанный материал на
тонких подложках.
7.7.5. Тонкие образцы
Использование тонких срезов значительно упрощает количественный анализ
биологических материалов. Электроны теряют лишь малую часть своей энергии
при прохождении через образец, и отражение электронов от образца
настолько мало, что им можно пренебречь. Вторичная флуоресценция
рентгеновского излучения пренебрежимо мала, и поглощение рентгеновского
излучения мало, за исключением очень Легких элементов, таких, как натрий.
Единственный эффект генерации рентгеновского излучения, который
необходимо рассмотреть,- это вероятность ионизации атома данного
элемента, описываемая сечением ионизации:
Qa(l/?0?Kp)log(?0/?Kp), (7.79)
где Екр - критическая энергия возбуждения данной рентгеновской линии и
Е0- энергия первичного пучка. Максимальная эффективность генерации
рентгеновского излучения достигается в том случае, когда энергия
электронов примерно в 3 раза выше критической энергии возбуждения данной
рентгеновской линии. Поскольку критические энергии возбуждения
рентгеновских линий большинства элементов в тонких срезах биологического
материала лежат между 1 и 10 кэВ, энергии электронов, применяемых в
растровых (30-50 кэВ) и просвечивающих (75-200 кэВ) электронных
микроскопах, значительно выше 3 ?кр-
Удобно разделить количественные методики для анализа тонких биологических
