Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
количественно аналитические результаты, наиболее точно напоминающие
условия, существующие в живой ткани. Важно распознавать артефакты,
связанные с переходным таянием или полным оттаиванием, случайной
регидратацией срезов, полученных лиофильной сушкой, перераспределением
электролитов за счет мигрирующей рекристаллизации льда и загрязнением
замороженных срезов.
12.3.9. Получение изломов
Другим способом вскрытия внутренней поверхности гидратированного или
высушенного лиофильной сушкой биологического материала для микроанализа
является разламывание образца при низкой температуре и исследование и
анализ либо высушенной лиофильной сушкой, либо замороженной в
гидратированном состоянии поверхности. Несмотря на ограничения,
накладываемые рентгеновским микроанализом массивных образцов, ряд
исследователей использовали эту методику для анализа. В работе [471]
подвергали анализу ионы, продиффунди-ровавшие в массивную замороженную
личиночную ткань; в [308] анализировалось содержимое кишки личинки
Chironomus\ в [472] измерялись концентрации электролитов в поперечном
сечении корней береговых растений. В работе [295] проводился анализ
замороженной в гидратированном состоянии дифференцированной ткани корня
Lemna minor. На рис. 12.15 показаны некоторые предварительные результаты,
и, хотя ясно, что разрешение в рентгеновских лучах не лучше 5 мкм, метод
обеспечивает простой и конкретный путь анализа замороженных в
гидратированном состоянии тканей. Образцы препарировались пу-
314
Глава 12
Рис. 12.15. Рентгеновский микроанализ со спектрометром с дисперсией по
энергии поверхности скола замороженного корня Lemna minor.
Молодые корни были обработаны для криозащиты 25%-ным гидрооксиэтиловым
крахмалом, смонтированы на бериллиевых объектодержатслях. быстро
заморожены в жидком азоте, сколоты и слегка протравлены в биокамере'
AMRAY при температуре 100 К. Поверхность излома была покрыта слоем
углерода толщиной 20 нм и анализировалась при температуре 120 К в
растровом электронном микроскопе AMR 1000, осиащсниом детектором фирмы
Kevex. Анализ проводился при использовании уменьшенного растра размером I
мкм2 при 20 кэВ, токе пучка 0,5 нА и времени счета 100 с. В верхнем левом
углу изображение во вторичных электронах поверхности скола корня,
замороженного в гидратированном состоянии, на котором видно кольцо клеток
лубяной паренхимы, окружающее центральную клетку ксилемы. Одна из клеток
лубяной паренхимы была разделена иа элемент сита А и сопутствующую клетку
В, и аналитические результаты были получены с этих двух клеток вместе с
результатами клетки лубяной паренхимы С, относительно которой
предполагалось, что оиа прошла диффереицировку для формирования второй
пары элемента сита и соседних клеток, обычно обнаруживаемых в этом
растении. А-В - аналитические результаты, полученные с этих клеток. Во
всех клетках обнаружено большое количество фосфора и серы, обычно
обнаруживаемых в меристе-матических клетках меристемы. Содержания калия,
хлора и магния приблизительно одинаковы во всех трех клетках, но в
элементе сита А отсутствует кальций, который присутствует как в
сопутствующей клетке В, так н в лубяной паренхиме С. Следует отметить,
что результаты, представленные здесь, являются лишь визуальным
представлением спектров, которые претерпели обработку, обратную свертке,
и которые показывают, что-относительные элементные концентрации
существенно различаются. Маркер на микрофотографии соответствует 10 мкм.
Препарирование биологических образцов для РМА
315
тем монтажа подвергнутого быстрому воздействию непроникающего полимерного
криопротектанта объекта в маленький (~ 1 мм) держатель и быстрого
замораживания в жидком азоте. Замороженные образцы переносятся в жидком
азоте на предварительно охлажденный столик специальной биологической
камеры образцов РЭМ. Это специально сконструированное устройство является
приставкой для растрового электронного микроскопа, позволяет производить
разламывание образца, травить и наносить покрытие на образцы в строго
контролируемых условиях низкой температуры и высокого вакуума [302].
Можно многократно разламывать образцы с помощью установленного под
фиксированным углом холодного ножа, высота которого устанавливается с-
помощью микрометра. Процесс излома может наблюдаться в бинокулярный
микроскоп. Поверхности излома могут протравливаться в контролируемых
условиях с помощью теплового излучателя и покрываться углеродом или
металлической пленкой до переноса образцов на охлаждаемый столик
микроскопа, где они исследуются и анализируются при низких температурах.
Все препарирование проводится при низких температурах (-~100 К) в чистом
высоком вакууме (50 мкПа) с гарантией того, что образец остается
полностью замороженным в гидратированном состоянии. Возможность контроля
уровня плоскости разлома означает, что можно получать гладкие поверхности
излома, необходимые для анализа массивных объектов. Дополнительная
