Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
4.3. Дехорионизация эмбрионов
Перед тем как игла проникнет в оплодотворенное яйцо и введет внутрь порцию ДНК, его прочная хорионическая мембрана («скорлупа») должна быть удалена; такой эмбрион защищен от внешнего мира только внешней вителлиновой мембраной. Существуют два способа дехорионизации: механический и химический. Целесообразно, если это возможно, проводить дехорионизацию и все последующие процедуры при 18 °С, чтобы замедлить развитие эмбрионов.
4.3.1. Механическая дехорионизация
Свежеотложенные яйца обрабатывают, осторожно накатывая их на липкую поверхность. Это делают под микроскопом (10—15Хувеличение) следующим образом. Готовят рабочую поверхность из двух предметных стекол, соединяя их встык с помощью липкой ленты. На одно стекло наклеивают полоску двусторонней липкой целлофановой ленты. На другое стекло прикрепляют липкой лентой или же каплей воды покровное стекло, в центре которого наклеивают очень узкую (1—2 мм) полоску двусторонней ленты. Эту задачу можно облегчить, если наклеить сначала более широкую полоску ленты, а затем удалить лишнее скальпелем или лезвием бритвы.
Соберите яйца с поддона либо под микроскопом с помощью часового пинцета, либо увлажненной мягкой кисточкой и пере-
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы
393
несите их на широкую полоску липкой ленты. Под микроскопом скатайте пинцетом маленький шарик клея, соскоблив его с липкой ленты, и крепко держите: этот клеевой шарик защитит яйцо от твердого металла пинцета и поможет захватить дехорио-низированное яйцо. Осторожно раскатайте яйца по поверхности! липкой ленты; каждое яйцо катайте до тех пор, пока хорион не' отделится и не обнажится вителлиновая мембрана. После этого яйцо закатывают с липкой поверхности обратно на участок приклеившейся хорионической мембраны, с которой его можно легко захватить с помощью клеевого шарика. Дехорионизирован-ные яйца переносят на узкую полоску липкой ленты, наклеенную на покровное стекло, и проводят микроинъекции, как это описано ниже, в разд. 4.3.3.
По мере приобретения необходимых практических навыков процедура дехорионизации уже не кажется очень сложной, а потери биоматериала сводятся к минимуму.
4.3.2. Химическая дехорионизация
Хлорная известь (гипохлорит натрия) быстро разрушает хорион яйца, не повреждая при этом развивающийся зародыш (однако на жизнеспособность эмбриона может повлиять качество конкретной партии извести). Используйте 50%-ный раствор хлорной извести и слегка охлажденную (до 18 °С) воду. Осторожно перенесите собранные яйца с помощью увлажненной мягкой кисточки или просто смыв их струей воды на фильтровальную воронку типа Millipore диаметром 1 см с фильтром Whatman CF-C и промойте их при небольшом отрицательном давлении. При переносе постарайтесь захватить как можно меньше дрожжевой массы, так как она может забить фильтр. Выключите вакуумный насос, налейте в воронку раствор извести и оставьте на 1—2 мин. Включите вакуумный насос и аккуратно удалите раствор. Промойте дехорионизирован-ные яйца два-три раза дистиллированной водой.
Переложите фильтр на столик микроскопа. Обычно яйца собираются в центре фильтра. Влажной кисточкой перенесите их с фильтра на чистое предметное стекло, а затем с помощью тонкой иглы или пинцетом по одному — на полоску липкой ленты, наклеенную на покровное стекло. Маленький клеевой шарик, удерживаемый пинцетом, облегчит задачу.
4.3.3. Раскладывание эмбрионов
Дехорионизированные яйца следует располагать так, чтобы их задние концы выступали за пределы узкой полоски двусторонней липкой ленты, наклеенной на покровное стекло (выступающее микропиле на переднем конце яйца служит хорошим
394
Глава 5
указателем для его ориентации). В свою очередь покровное стекло можно закрепить на предметном стекле либо с помощью капли воды, либо липкой лентой.
Раскладывая эмбрионы, целесообразно располагать их группами по пять. Это облегчает подсчет и позволяет без труда идентифицировать нужное яйцо, если, например, возникла необходимость удалить «неуколотый» эмбрион. На одном стекле можно разложить от 50 до 75 яиц — на это уходит 15—20 мин. Может быть, на первый раз легче приготовить два или три отдельных стекла — по 25 яиц на каждом — и высушивать их по очереди.
Замечено, что разные марки целлофановой ленты и даже разные партии ленты одного и того же типа по-разному влияют на жизнеспособность дехорионизированных эмбрионов. Поэтому имеет смысл проверить имеющиеся в расположении типы ленты: прикрепить яйца, покрыть их маслом и подсчитать потом число эмбрионов, развившихся до стадии личинки.
4.4. Высушивание
Весьма важно, чтобы эмбрионы были подсушены перед тем, как в них будет введен довольно значительный объем раствора ДНК- Этот этап является критическим при подготовке эксперимента, но, к сожалению, он с трудом поддается количественному учету: оптимальная степень высушивания варьирует в зависимости от конкретных экспериментальных условий. Пересушивание резко снижает жизнеспособность дехорионизированных эмбрионов даже без инъекции. Если же яйца недостаточно подсушены, их содержимое начинает выделяться наружу при прокалывании иглой вителлиновой мембраны. Оптимальную степень высушивания определяют эмпирически.
