Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
390
Глава 5
ному гену. Критерием отбора трансформантов в этом случае будет восстановление нормального фенотипа. В тех случаях, когда рекомбинантная конструкция на основе P-элемента внешне не проявляется или же экспрессия исследуемого гена не гарантируется (например, при изучении активности промотора в серии делеционных мутантов), трансформантов отбирают с помощью маркерного гена, например Adh или rosy; реципиентная линия мух должна при этом нести мутацию соответствующего эндогенного гена. И наконец, если селекцию проводят на основе лекарственной устойчивости, используя в качестве генетического маркера ген neoR, хозяйская линия может иметь любую генетическую конституцию, включая дикий тип.
4. Подготовка препаратов для микроинъекций
4.1. Оборудование и материалы для микроинъекций
Лабораторный микроскоп (увеличение 10—ЗОХ) Инвертированный микроскоп (увеличение 150—200Х) с выключенным или заэкранированным источником света. Желательно иметь столик с охлаждением или работать в комнате, где температура поддерживается на уровне 18 °С (однако это не обязательно).
Микроманипулятор и держатель микроинструмента. Необходимость этих приборов очевидна, если учесть, что перемещение иглы требуется ограничить интервалом в несколько десятков микрон.
Предметные стекла Покровные стекла Часовой или глазной пинцет Хлорная известь (гипохлорит натрия)
Двусторонняя липкая лента (Scotch или Sellotape) Электрический аппарат для вытягивания игл, например Vertical pipet puller модель 700С
Микрокапилляры, желательно с внутренним филаментом Такие капилляры выпускаются фирмами W. P. Instruments и Clark Electromedical Instruments. Капилляры необходимо промыть фильтрованным абсолютным этанолом и высушить
Drierit, хлористый кальций, силикагель или аналогичный осушитель
Пластиковый шприц на 25 или 50 мл
Пластиковые трубки для соединения шприца с держателем микроинструмента и иглой
Чашки Петри разового пользования Фильтровальная бумага
Масло Halocarbon серия 700 или Voltalef grade 10S
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы____________391
Камеры для сбора яиц — флаконы или небольшие пеналы Поддоны для сбора яиц, агар с добавлением виноградного сока или мелассы (2,5% агар)
4.2. Сбор ранних эмбрионов
Полное описание жизненного цикла Drosophila, а также ме-тодов разведения и культивирования мух можно найти в книге [25].
Здоровая популяция мух гарантирует хороший выход яиц. Наибольшее количество здоровых яиц откладывают молодые самки (в возрасте 3—7 дней). Особенно это характерно для мух гу-линий, плодовитость которых резко падает по достижении ими недельного возраста.
Перед тем как приступить к сбору яиц, выдержите только что вылупившихся мух в течение 2—3 дней на свежей среде, обогащенной дрожжевой пастой. Мух можно содержать в небольшом пенале, куда следует поместить поддон для сбора яиц. Альтернативный путь — поместить несколько сотен мух в сосуд с двумя отверстиями, одно из которых закрывают поддоном для сбора яиц, а другое — ватной пробкой, обеспечивающей достаточно эффективную вентиляцию. Можно закрыть одно из отверстий шелковой сеткой и затем поставить сосуд этим отверстием на поддон с кормом: самки будут откладывать яйца сквозь сетку, и для сбора следующей порции яиц достаточно перенести сосуд на новый поддон. Важно лишь следить за тем, чтобы сосуд оставался чистым. По мере того как стенки сосуда загрязняются выделениями мух и частицами дрожжевой массы, переносимыми на их лапках, эти стенки становятся более предпочтительными местами для откладывания яиц и конкурируют с поддоном.
Поддоны для сбора яиц заполняют массой из виноградного сока и агара или же из мелассы и агара и в центре помещают небольшое количество свежей дрожжевой пасты. Поскольку шероховатая поверхность обычно стимулирует откладывание яиц, гладкий агар можно слегка поцарапать иглой, чтобы побудить мух откладывать яйца в образовавшиеся бороздки и тем самым облегчить сбор яиц.
Самки мух откладывают яйца в соответствии со своими циркадными ритмами, которые, однако, часто не совпадают с распорядком дня исследователя. Пик откладки яиц обычно приходится на ранние вечерние часы, хотя возможны вариации — это зависит от конкретной линии. Здесь может помочь инкубатор с обращенным суточным циклом. Следует, однако, учесть, что мухи должны содержаться в таком инкубаторе на протяжении всей их жизни, так как биоритмы закладываются на стадии личинки и сохраняются во взрослом состоянии.
592
Глава 5
Для сбора яиц подложите мухам свежую чашку с небольшим мазком дрожжей и содержите их в темном спокойном месте при комнатной температуре. Процедура трансформации предусматривает инъекцию ДНК в эмбрион на ранних этапах дробления (0—2 ч при 25 °С) до того момента, когда вокруг разделившихся ядер начинают формироваться клетки. Обычно одночасовой сбор яиц обеспечивает вполне приемлемую степень синхронности. Однако первый дневной сбор в работу брать нельзя, так как самки могут задерживать откладку оплодотворенных яиц на несколько часов, вследствие чего к моменту сбора эти яйца оказываются уже на неподходящей для планируемого эксперимента стадии развития. Между прочим отметим, что один час — это приблизительно то время, которое требуется одному работнику, чтобы дехорионизировать, разложить, высушить и «уколоть» 50—75 эмбрионов — еще и останется несколько минут, чтобы передохнуть. В ряде случаев мух, не отложивших яйца, можно стимулировать к кладке, если содержать их в условиях дрожжевого голодания (подложив им чашку только с агаризованным виноградным соком), а затем, через несколько часов, перевести на обычный корм.
