Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 176

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 170 171 172 173 174 175 < 176 > 177 178 179 180 181 182 .. 253 >> Следующая

25*
388
Глава 5
обнаружено ни одного мобильного дефектного P-элемента, который имел бы делецию в области 100 нуклеотидов, локализующихся у его левой границы [14].
Описан целый ряд Р-векторов [16], которые содержат внутри области, ограниченной инвертированными повторами, синтетические полилинкеры. Это векторы серии Carnegie, несущие уникальные сайты рестриктаз Pstl, Sail, ВатШ, EcoRI и др. (рис. 1В); структурной основой этих векторов служит плазмида pUC8. Вектор Carnegie 20 (рис. 1, Г) имеет в своем составе P-элемент, в который введен 7,3 т. п. н-Яг'ясИП-фрагмент ДНК, содержащий ген rosy. Вектор несет уникальные сайты рестриктаз Sail и Hpal, которые могут использоваться в качестве сайтов клонирования ДНК- Позднее были сконструированы векторы, маркированные неок [11].
Принятая в настоящее время номенклатура рекомбинантных Р-элементов [22] предусматривает использование квадратных скобок для обозначения концевых обращенных повторов элемента. Генетический материал, заключенный между этими повторами, обозначается соответствующими символами внутри скобок. Согласно этой номенклатуре, вектор Carnegie 20 имеет обозначение Р[rosy], а, например, транспозон, несущий ген Adh,— Р [Adh],
3.4. Потребность во вспомогательном (хелперном) элементе
Как мы уже упоминали в разд. 2.3, дефектные рекохмбинант-ные Р-транспозоны способны перемещаться по геному только в присутствии некоего транс-функционального фактора, который кодируется недефектными P-копиями. Поэтому сначала в качестве хелперного элемента в экспериментах по трансформации использовали 2,9 т.п. н.-элемент клона ря25.1 (один из двух интактных P-элементов, которые были клонированы и секвени-рованы О’Харом и Рубином [14]). Однако, будучи интактным автономным элементом, он сам мог транспозироваться в геном реципиентной мухи наряду с рекомбинантным Р-элементом. Двойная интеграция — дефектного и недефектного элемента — в один реципиентный геном обусловливает генетическую ситуацию, эквивалентную той, которая возникает при гибридном дис-генезе. В результате рекомбинантный P-элемент оказывается генетически нестабильным: происходят множественные акты вы-щепления его из генома и перемещения в новые хромосомные локусы. Нестабильные трансформанты довольно трудно должным образом охарактеризовать; необходимы повторные скрещивания и отбор, чтобы генетическими методами удалить интегрированный хелперный элемент из генома. Чтобы уменьшить риск двойной интеграции, методика трансформации предусматривала использование смеси соответствующих плазмид (содержащих
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы_____________389
исследуемый рекомбинантный P-элемент и содержащих хелпер-ный элемент) с молярным отношением 5 -1 [1].
Более удобный вариант хелперного элемента ввели в практику эксперимента Кэресс и Рубин [15]. Этот элемент, клони-рованный в виде плазмиды pn25.7wc (wc — от англ. wings-clip-ped), позволил обойти упомянутые трудности. Он экспрессирует транспозазу, однако сам не способен транспозироваться ввиду' того, что область между 23 и 31 нуклеотидами правого инвертированного повтора удалена. Наличие только одного функционального концевого повтора лишает этот P-элемент мобильности. Было показано, что новый хелперный элемент столь же эффективен, как и ря25.1, и в то же время пока не известно ни одного случая, когда бы он встроился в реципиентный геном.
При использовании в трансформационных экспериментах pn25.7wc молярное соотношение дефектного рекомбинантного элемента и хелперного элемента следовало бы изменить. К сожалению, специальных исследований по определению их оптимального количественного соотношения проведено не было (см. обсуждение экспериментов в разд. 4.6).
3.5. Выбор реципиентной линии мух для трансформации
При выборе реципиентной линии мух для планируемой инъекции P-элемента следует учитывать два основных требования. Во-первых, это должна быть М-линия, и желательно, чтобы у этой М-линии отсутствовали любые последовательности, способные гибридизоваться с P-элементами. Во-вторых, фенотип этих мух должен обеспечивать возможность идентификации особей, экспрессирующих ген, введенный в составе рекомбинантного P-элемента (см. разд. 3.2).
Хотя большинство лабораторных линий мух в действительности относится к М-типу, известно, что некоторые из них содержат в геноме несколько копий (а в ряде случаев много копий) дефектных Р-элементов [23, 24]. Эти эндогенные копии могут снижать эффективность трансформации за счет конкуренции с инъецированным рекомбинантным P-элементом за транспозазу. Кроме того, они могут создавать трудности при последующем молекулярном анализе трансформантов. Наиболее простой способ обнаружить наличие P-элементов в геноме мух, рассматриваемых в качестве потенциальных реципиентов, — анализ их ДНК методом блот-гибридизации [28].
Трансформированная особь фенотипически должна отличаться от нетрансформированных мух. Если интересующий ген имеет внешнее фенотипическое проявление и есть уверенность в том, что он сохраняет интактную структуру в составе Р-векто-ра, этот ген можно вводить непосредственно в хозяйскую особь, которая является гомозиготным рецессивным мутантом по дан-
Предыдущая << 1 .. 170 171 172 173 174 175 < 176 > 177 178 179 180 181 182 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed